Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., Des souris déficientes en GPR174 ont été générées par des procédures standard de ciblage génétique pour remplacer le cadre de lecture ouvert Gpr174 par une cassette LacZ/neo utilisant la lignée de cellules souches embryonnaires 129svevbrd (Texas a&m Institute for Genomic Medicine, TG0128). Ces souris déficientes en GPR174 ont été rétrocroisées à des souris C57BL / 6 pendant 12 générations. Des souris pertinentes sur le fond C57BL / 6 ont été croisées pour obtenir des souris MD4 exprimant GFP et des souris MD4 exprimant gpr174 exprimant dsRed-suffisantes ou déficientes., Des compagnons de litière appariés entre 6 et 12 semaines et des sexes indiqués ont été utilisés pour des expériences. La taille des échantillons pour les expériences chez la souris a été déterminée empiriquement, et les souris ont été assignées au hasard au groupe témoin ou expérimental. Aucun aveuglement n’était nécessaire pour les expériences de souris présentées ici. Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques sans pathogène et ont été utilisées conformément aux directives gouvernementales et institutionnelles du Comité de soins et D’utilisation des animaux de Tsinghua pour le bien-être des animaux.,
souris transgéniques BAC GPR174–GFP
des séquences codant pour l’éditeur de liens glycine–glycine–glycine–sérine (GGGS) (répétées quatre fois) et la GFP améliorée (EGFP) ont été insérées immédiatement avant le codon stop du cadre de lecture ouvert GPR174 dans le clone BAC de souris RP23-206j14 par recombinaison homologue. Le BAC modifié a été purifié et micro-injecté dans les pronucléi d’ovules fertilisés pour générer des reporters transgéniques. Une souris fondatrice qui a été testée positive pour les cellules B exprimant la GFP dans le sang a été utilisée pour se reproduire avec des souris B6 afin d’établir la souche BAC GPR174–GFP.,
culture cellulaire, rétrovirus et transduction in vitro
Les cellules T naïves ou les cellules B ont été isolées à l’aide du kit D’isolement des cellules T CD4 négatives ou du kit D’isolement des cellules B naïves (Miltenyi Biotec) selon les protocoles du fabricant. Pour surexprimer les gènes cibles dans les cellules B, les cellules B purifiées ont été activées avec 1 µg ml−1 lipopolysaccharide (Sigma) pendant 1 jour avant d’être infectées par spin avec des surnageants rétroviraux à 1 500 g pendant 2 h, comme décrit18.
Construction de chimères à moelle osseuse
des souris receveuses B6 ont été irradiées de façon létale par rayons X (5.,5 Gy, deux fois), puis un transfert intraveineux de 3 × 106 cellules de moelle osseuse appariées selon le sexe, composées de 80% de cellules µMT et de 20% de cellules GPR174-suffisantes ou déficientes. Les chimères ont été utilisées pour des expériences six à huit semaines après la reconstitution.
Gonadectomie
Les souris après le sevrage ont été anesthésiées avec avertin (2,5%, 0,015 ml de poids corporel g−1) par voie intrapéritonéale. Pour l’ovariectomie de souris femelles, les ovaires des deux côtés ont été exposés et enlevés par des incisions dorsales bilatérales., Pour l’orchidectomie chez les souris mâles, une incision abdominale médiane a été pratiquée pour exposer et retirer les testicules des deux côtés. Des souris témoins opérées de manière simulée ont subi une intervention chirurgicale comprenant des incisions dorsales bilatérales ou une incision abdominale médiane sans ablation des ovaires ou des testicules. Les ouvertures des plaies chirurgicales ont été suturées et des antibiotiques et des analgésiques ont été appliqués localement. Les souris ont été autorisées à récupérer pendant huit semaines avant des expériences ultérieures.,
traitement à la testostérone
des souris âgées de Six à huit semaines ont reçu une injection sous – cutanée de testostérone (10 mg kg-1 poids corporel) dissoute dans de l’huile de graines de tournesol tous les deux jours pendant deux semaines. Les souris témoins du véhicule ont été traitées avec de l’huile de tournesol seule.
transfert adoptif, immunisation et infection virale
pour mesurer la formation du centre germinal par les lymphocytes B MD4, 105 lymphocytes T OT-II et 5 × 105 lymphocytes B MD4 des génotypes indiqués ont été transférés par voie intraveineuse chez des receveurs mâles B6, qui ont ensuite été immunisés par voie sous-cutanée avec 0.,5 µg de lipopolysaccharide et 30 µg d’antigène conjugué HEL–OVA dans l’alun (Thermo Scientific). Les HEL-OVA ont été fabriqués par réticulation chimique avec un kit de conjugaison HydraLink (SoluLink) tel que décrit antérieurement19. Pour mesurer la formation du centre germinal en réponse à l’immunisation par le SRBC ou à une infection par le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), on a injecté à des souris par voie intrapéritonéale 5 × 108 SRBC (provenant de Z. Baiji) ou 2 × 105 unités formant des plaques du virus LCMV Armstrong (provenant de L. Ye et R. Ahmed).,
EAE par immunisation des protéines MOG
la séquence codant les 120 premiers acides aminés de MOG humain a été amplifiée par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir d’une bibliothèque d’ADN complémentaire du cerveau humain, et clonée entre les sites NdeI et XhoI du vecteur d’expression pET22b+ (Novagen). La protéine mog humaine a été exprimée dans BL21 (DE3) Escherichia coli et purifiée par son tag carboxy-terminal histidine (His). La pureté et la concentration des protéines ont été évaluées par analyse de la protéine SDS–PAGE et de l’acide bicinchoninique (BCA), respectivement. Les protéines recombinantes ont été stockées à -80 °C jusqu’à leur utilisation., Pour induire des EAE, des animaux chimériques de moelle osseuse des types indiqués ont été immunisés par voie sous-cutanée au niveau du flanc avec 200 µg de protéine mog humaine recombinante émulsionnée dans l’adjuvant complet de Freund au jour 0. On a injecté à des souris par voie intraveineuse 200 ng de toxine coquelucheuse (Invitrogène) aux jours 0 et 2. Les souris ont été surveillées quotidiennement de manière aveugle pour la progression de la maladie à partir du jour 1. La gravité de la maladie a été notée comme suit: 0, aucun signe clinique; 1, queue paralysée; 2, Perte de mouvement coordonné et parésie des membres postérieurs; 2.5, paralysie d’un membre postérieur; 3, paralysie des deux membres postérieurs; 3.,5, paralysie des deux membres postérieurs et faiblesse des membres antérieurs; 4, paralysie des membres antérieurs; et 5, moribond. Pour comparer la gravité de la maladie, nous avons étudié dix souris par affection et par expérience, et analysé les scores de la maladie au fil du temps avec L’ANOVA bidirectionnelle.
cytométrie en flux
mesure des titres d’anticorps spécifiques à l’antigène
pour mesurer les titres D’anticorps spécifiques au SRBC, nous avons lysé 5 × 108 SRBC avec 1 ml d’eau double distillée et les avons centrifugés à 15 000 tr / min pendant 20 min., La pastille a été remise en suspension dans du PBS et utilisée pour enrober les plaques Elisa (Nunc Maxisorp) pendant une nuit à 4 °C. Pour mesurer les anticorps sériques spécifiques au MOG, nous avons utilisé 2 µg ml-1 de MOG humain recombinant purifié pour enrober les plaques ELISA. La liaison non spécifique a été bloquée avec 1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans le PBS avec Tween-20 (PBST) pendant 2 h à 37 °C, suivie D’une incubation avec 2× dilutions sériques d’échantillons sériques de souris immunisées pendant 1 h à 37 °C., Les plaques ont été lavées et incubées avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1/20 000) pendant 1 h à 37 °C. Les plaques ont été lavées,développées avec de la 3,3′, 5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) et arrêtées avec 1 m de HCl. Nous avons fixé les puits vides à zéro et enregistré l’absorbance à 450 nm. Nous avons utilisé des sérums de souris non immunisées comme témoin négatif; la valeur de coupure était la densité optique à 450 nm (OD450) du témoin négatif multipliée par 2,1. Un puits dont la valeur OD450 n’est pas inférieure à la valeur seuil a été considéré comme positif., La dilution la plus élevée d’un échantillon qui a donné la positivité est le titre de l’échantillon.
Distribution des cellules B par immunohistochimie
pour diverses expériences, des cellules B naïves, des cellules B activées pendant 1 h avec 10 µg ml−1 F(ab’)2 IgM anti-souris de chèvre (Jackson Immunoresearch), ou des cellules B transductées par rétrovirus ont été transférées dans des receveurs B6. Au besoin, ces cellules ont été marquées avec 1 µM de tétraméthylrhodamine (TAMRA), 4-chlorométhyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarine (CMF2HC) ou 5-chlorométhylfluorescéine diacétate (CMFDA) (Invitrogen)., Les spléens ou ganglions lymphatiques inguinaux des souris receveuses ont été fixés avec 1% de paraformaldéhyde pendant 12 h, puis déshydratés dans une solution de saccharose à 30% pendant 12 h à 4 °C. Pour assurer une représentation maximale des différentes régions d’organes dans l’ensemble de données final, nous avons traité des sections de tissu non consécutives et les Les réactifs de coloration inclus eFluor450-IgD( eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), lapin anti-GFP (abcam), et AF488 chèvre anti-lapin IgG (Invitrogen)., Les lames ont été montées avec le réactif AntiFade ProlongGold (Invitrogen) et examinées avec un microscope vertical Olympus FV1000. Les Images ont été analysées avec Imaris (Bitplane) et ImageJ 1.46 r (Instituts Nationaux de la Santé).
préparation de stroma splénique
Les fentes de souris, de rats ou de porcs ont été pressées et broyées à plusieurs reprises contre un treillis métallique pour libérer les globules rouges et les lymphocytes. Les autres éléments insoupçonnés et amorphes du tissu stromal ont été soigneusement lavés avec du PBS avant d’être placés dans un milieu de culture B27 sans sérum (Invitrogène) et incubés à 37 °C pendant 12 h., Pour les souris, des éléments stromaux de trois animaux ont été cultivés dans un milieu de 1 ml. Pour les porcs, des éléments stromaux de 1 Rate ont été cultivés dans 80 ml. La culture résultante a été centrifugée à 10 000 tr / min pendant 60 min pour obtenir le milieu conditionné, qui a été soit immédiatement utilisé pour des expériences, soit congelé à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
analyse Transwell
des cellules B activées avec 1 µg ml−1 de lipopolysaccharide pendant 60 h ont été utilisées pour analyser différentes fractions résultant du fractionnement biochimique., Des cellules B naïves ou des cellules B activées avec 10 µg ml−1 F(ab’)2 IgM anti-souris de chèvre (Jackson Immunoresearch) et 10 µg ml−1 anti-CD40 (clone FGK4.5, Bio X Cell) ont été utilisées pour tester la migration induite par le CCL21. Lorsque les cellules B de différents génotypes ont été comparées, au moins trois souris donneuses de chaque génotype et traitement ont été utilisées pour isoler les cellules B dans chaque expérience, et les compagnons de lit ont toujours été utilisés. Les cellules B ont été mises en suspension à 106 cellules par millilitre et reposées dans un milieu RPMI contenant 1% de FBS à 37 °C pendant 1 h., Ensuite, un total de 100 µl de suspension cellulaire a été ajouté à la chambre supérieure dans un Transwell à pores de 5 µm (Corning Costar), et un total de 150 µl de solutions contenant un attractif a été ajouté à la chambre inférieure. Ces solutions comprenaient un milieu de culture conditionné avec une préparation brute de stroma splénique de souris, un milieu de culture conditionné avec une préparation brute de stroma splénique de porc, des fractions d’élution à partir de la chromatographie, un milieu de culture contenant des ccl21 et CCL19 recombinants (Peprotech), ou 18/0 LysoPS (lipides Avanti polaires) de concentrations indiquées., Pour certaines expériences, le milieu conditionné par stroma murin a d’abord été complété par une concentration finale de 5 µg ml−1 d’anticorps neutralisants contre la souris CCL21 ou ccl19 (système R&D) ou le contrôle de l’isotype IgG de chèvre, et incubé à 4 °C pendant 3 h avant d’être utilisé pour le test transwell. La dose d’anticorps était au moins suffisante pour neutraliser 100 ng ml−1 CCL21 ou CCL19, comme déterminé dans les expériences préliminaires. On a laissé les cellules se transmigrer pendant 3 h à 37 °C dans un incubateur., Les cellules qui avaient migré vers les puits de fond ont été dénombrées par cytométrie en flux, avec des cellules A20 fluorescentes de nombres connus ajoutées immédiatement avant la lecture en tant qu’étalon de comptage interne. Chaque condition a été mesurée dans des puits en trois exemplaires, sauf indication contraire.
fractionnement biochimique
La chromatographie a été réalisée à L’aide d’un système de chromatographie liquide à protéine rapide ÄKTApurifer 10 (GE Healthcare) à 4 °C, à l’exception de la dernière étape, qui a été réalisée à l’aide d’un système ÄKTAmicro FPLC (GE Healthcare)., Un total de 1 200 ml de milieu conditionné par stroma porcin a été appliqué sur une colonne échangeuse d’anions (volume de lit de 250 ml) équilibrée avec un tampon I (Hepes de 25 mM, pH 7,0). La colonne a été lavée avec trois volumes de colonne avant d’être éluée avec trois volumes de colonne de tampon I complétés par 1 m de NaCl. Le débit a été modifié en tampon avec le tampon II (Tris-HCl de 25 mM, pH 8,5) en 100 ml et réappliqué dans une colonne échangeuse d’anions équilibrée avec le tampon II. la colonne a été lavée avec deux volumes de colonne de tampon II et éluée avec deux volumes de colonne d’un gradient linéaire de NaCl de 0,1-0,5 M., Des Fractions de 10 ml chacune ont été recueillies, et les aliquotes ont été modifiées en tampon avec RPMI 1640 pour le test transwell. Les fractions actives ont été regroupées et le tampon a été transformé en 10 ml avec le tampon II et chargé sur une colonne d’héparine (volume de lit de 5 ml) équilibrée avec le tampon II. la colonne a été lavée avec 12 volumes de colonne de tampon II et éluée avec 4 volumes de colonne de gradient linéaire de NaCl de 0-2 M. Des Fractions de 2 ml chacune ont été recueillies et les aliquotes ont été changées en tampon avec RPMI 1640 pour le test transwell. Les fractions actives ont de nouveau été mises en commun, tampon-changé en 0.,5 ml de tampon I et chargé sur une colonne Superdex-75 (volume de lit de 24 ml) équilibré avec le tampon I. La colonne a ensuite été éluée avec un volume d’une colonne de tampon I. des Fractions de 0,5 ml chacune ont été collectées, et les aliquotes ont été modifiées avec RPMI 1640 pour le test transwell. Les fractions actives ont été regroupées et concentrées en 0,5 ml pour être chargées sur une colonne Mono S (volume de lit de 1 ml) équilibrée avec le tampon I. La colonne a été lavée avec 12 volumes de colonne de tampon I et éluée avec 25 volumes de colonne de gradient linéaire de NaCl de 0-0, 5 m., Des Fractions de 1 ml chacune ont été recueillies, et les aliquotes ont été modifiées en tampon avec RPMI 1640 pour le test transwell. Les fractions actives ont été regroupées, modifiées et concentrées en 50 µl avec le tampon I, puis rechargées sur la colonne Mono s équilibrée avec le tampon I. La colonne a été lavée avec trois volumes de colonne de tampon I contenant 0,3 m de NaCl et éluée avec 24 volumes de colonne de gradient linéaire de NaCl de 0,3 à 0,4 m., Des Fractions de 1 ml chacune ont été recueillies, et les aliquotes ont été modifiées en tampon avec RPMI 1640 pour le test final de transwell afin d’identifier la fraction qui contenait la plus forte activité chimioattractant.
analyse par spectrométrie de masse
Les Fractions de la dernière étape de purification ont été concentrées en 50 µl et analysées sur 12% de gels de NuPAGE (Invitrogen). Les Gels ont été colorés avec la tache D’argent Pierce pour la spectrométrie de masse (Thermo Fisher Scientific) selon le protocole du fabricant., Les bandes d’intensités accrues dans la fraction contenant la plus forte activité chimioattractive ont été excisées et soumises à une digestion en gel avant d’être analysées avec un spectromètre de masse Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). Les données de spectrométrie de masse ont été analysées à l’aide de la base de données Swissprot avec le moteur de recherche MASCOT.
analyse de recombinaison et de liaison de Ccl21 avec marquage His
la séquence codante ccl21 de souris a été amplifiée à partir D’ADNc de rate de souris C57BL / 6 et clonée entre les sites NdeI et XhoI du vecteur d’expression pET22b+ (Novagen), qui fournit une balise His C-terminale., La protéine recombinante a été exprimée chez des souris BL21(de3) et purifiée par son Tag His. La pureté et la concentration des protéines ont été évaluées par les tests SDS–PAGE et BCA, respectivement, et la bioactivité a été vérifiée à l’aide d’un test de mobilisation du calcium. Les protéines recombinantes ont été stockées à -80 °C jusqu’à leur utilisation. Pour mesurer la liaison de CCL21–His à GPR174, avec CCR7 comme témoin positif, les cellules 293T ont été transfectées avec des constructions de fusion GPR174–GFP ou CCR7–GFP., Des aliquotes de cellules transfectées ont ensuite été incubées avec la protéine Ccl21–His à des concentrations indiquées à 37 °C pendant 30 min, lavées deux fois avec du PBS froid et fixées immédiatement avec 4% de paraformaldéhyde. Après des lavages dans le PBS, les cellules fixes ont été colorées avec un anticorps anti-His conjugué à la phycoérythrine (clone J095G46, Biolegend) et analysées par cytométrie en flux., Les cellules GFP de chaque échantillon ont servi de contrôle interne de coloration de fond non spécifique, et l’intensité de fluorescence moyenne (IMF) des cellules GFP+ colorées avec un anticorps anti-His conjugué à la phycoérythrine, avec l’IMF des cellules GFP correspondantes soustraites, a été utilisée pour quantifier la liaison spécifique au CCL21.
mesure des flux de calcium déclenchés par la chimiokine
Les souris Gpr174 et Ccr7 ont été amplifiées par PCR et clonées dans le plasmide pRK5. Les cellules HEK293T ont été transitoirement transfectées avec un plasmide d’expression GPR174, ccr7 ou témoin., Les cellules ont été physiquement détachées du vaisseau de culture 48 h après la transfection, lavées deux fois avec du PBS et colorées avec 1 µM D’Indo-1 (Invitrogène) dans du PBS à 37 °C pendant 30 min. Après avoir été lavées deux fois avec du PBS, les cellules ont été remises en suspension avec la solution saline équilibrée de Hanks (Invitrogen) contenant 25 mm D’Hepes et 1% de FBS, et maintenues sur de la glace. Lorsqu’elles ont été soumises à une stimulation chimiokine, les cellules ont d’abord été introduites dans un lot d’eau à 37 °C pendant 5 min d’incubation, puis évaluées sur un cytomètre LSR II (BD Biosciences) pour établir la ligne de base de l’état non stimulé., Les cellules ont été stimulées avec une série de concentrations de ccl21 recombinant allant de 0,1 ng ml−1 à 10 µg ml−1. Les cellules de chaque État ont été continuellement surveillées et enregistrées pendant 2 min. À la fin, ionomycine (Sigma) a été ajouté à l’échantillon à une concentration finale de 1 µg ml−1, et l’échantillon a été contrôlé et enregistré pendant 1 min. Les rapports Indo-1(lié)/Indo-1(libre) ont été utilisés pour indiquer les concentrations intracellulaires de Ca2+, telles qu’analysées dans FlowJo (TreeStar). La plus forte concentration de Ca2+ stimulée par l’ionomycine a été utilisée à 100% pour normaliser la réponse calcique induite par le CCL21., La CE50 a été estimée dans GraphPad en ajustant une courbe dose-réponse non linéaire à trois paramètres.
immunoprécipitation et Western blotting
des cellules B de souris fraîchement isolées de souris transgéniques BAC GPR174–GFP ont été activées avec 10 µg ml−1 F(ab’)2 IgM anti-souris de chèvre et 10 µg ml−1 anti-CD40 pendant 48 h. Ces cellules B activées ont ensuite été suspendues à 2 × 107 cellules par millilitre dans un milieu RPMI contenant 1% de FBS, et laissées non traitées ou stimulées avec 300 ng ml−1 ccl21 à 37 °C pendant 30 Min. Les cellules B ont ensuite été immédiatement lysées dans un tampon de lyse NP-40 à 1% (Tris-HCl de 25 mM, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glycérol et inhibiteurs de protéase). Pour l’immunoprécipitation de GPR174 marqué par la GFP, des lysats de 108 cellules B ont été incubés pendant une nuit avec 20 µl de billes de Piège à GFP (ChromoTek). Après des lavages répétés, les immunoprécipités ont été élués par incubation dans un tampon de Glycine de 0,2 M (pH 3,0) pendant 10 min à température ambiante, puis neutralisés avec 1 M de Tris-HCl (pH 8,5). Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE et transférées à la membrane de polyvinylidène (Millipore). Les Membranes ont été bloquées avec une solution saline tamponnée TRIS contenant 5% de BSA et 0,1% de Tween 20., Pour détecter les molécules cibles par immunoblocage, nous avons utilisé des anticorps anti-GFP de lapin (Abcam), anti-Gai-1 de lapin (Abcam), anti-Gai-2 de lapin (Abcam) et anti-Ga13 de lapin (Abcam). L’anticorps anti-lapin de chèvre conjugué par HRP a été acheté auprès de Bioeasytech. Les Immunoblots ont été détectés à l’aide d’une chimiluminescence améliorée (Thermo Fisher Scientific), et les images ont été analysées avec le logiciel ImageJ.
PCR Quantitative
Les cellules des types souhaités ont été triées avec un FACSAria III et soumises à une extraction totale de L’ARN avec le kit RNeasy Plus Mini ou Micro (Qiagen) selon les instructions du fabricant., L’ARN a été transcrit de manière inverse avec tout-en-un rt MasterMix (Abm). La PCR Quantitative a été réalisée avec qPCR MasterMix (Abm) sur un système de PCR en temps réel 7500 (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., L’expression Relative des gènes cibles parmi différents échantillons a été comparée après normalisation à l’expression des gènes D’entretien Actb ou Gapdh.
analyse des données statistiques
Les statistiques et les graphiques ont été réalisés dans Prism (Graphpad). Sauf indication contraire, les tests T de Student non appariés à deux queues ont été utilisés pour comparer les moyennes des paramètres de différents groupes.
résumé des rapports
de plus amples renseignements sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la Nature lié au présent document.