Qu’est-ce que le séquençage Sanger?
le séquençage Sanger, également connu sous le nom de « méthode de terminaison de chaîne”, a été développé par le biochimiste anglais Frederick Sanger et ses collègues en 1977. Cette méthode est conçue pour déterminer la séquence des bases nucléotidiques dans un morceau d’ADN (généralement moins de 1 000 bp de longueur). Séquençage Sanger avec 99.,La précision de base de 99% est considérée comme la « norme d’or” pour la validation des séquences D’ADN, y compris celles déjà séquencées par le séquençage de nouvelle génération (NGS). Le séquençage Sanger a été utilisé dans le Projet Génome Humain pour déterminer les séquences de fragments d’ADN humain relativement petits (900 PB ou moins). Ces fragments ont été utilisés pour assembler des fragments D’ADN plus gros et, éventuellement, des chromosomes entiers.
Sanger Sequencing VS NGS
le développement des technologies NGS a accéléré la recherche en génomique. NGS peut séquencer simultanément plus de 100 gènes et génomes entiers avec de L’ADN à faible entrée., Le séquençage Sanger reste largement utilisé dans le domaine du séquençage car il offre plusieurs avantages importants: (i) rentabilité pour le séquençage de gènes uniques et (ii) précision de 99,99%, particulièrement adaptée au séquençage de vérification pour la mutagenèse dirigée sur site ou les inserts clonés.
Comment fonctionne le séquençage Sanger?
dans le séquençage Sanger, une amorce D’ADN complémentaire à l’ADN modèle (L’ADN à séquencer) est utilisée comme point de départ pour la synthèse de l’ADN., En présence des quatre désoxynucléotides triphosphates (dNTPs: A, G, C et T), la polymérase prolonge l’amorce en ajoutant le dNTP complémentaire au brin d’ADN modèle. Pour déterminer quel nucléotide est incorporé dans la chaîne de nucléotides, quatre didésoxynucléotides triphosphates (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP et ddTTP) marqués avec un colorant fluorescent distinct sont utilisés pour terminer la réaction de synthèse. Comparé à dNTPs, ddNTPs a un atome d’oxygène retiré du ribonucléotide, donc ne peut pas former un lien avec le nucléotide suivant., Après la synthèse, les produits de réaction sont chargés dans quatre voies d’un seul gel en fonction des divers nucléotides terminant la chaîne et soumis à une électrophorèse sur gel. Selon leurs tailles, la séquence de l’ADN est ainsi déterminée.
Figure 1. La structure de ddNTP et dNTP.
crédit D’Image: « séquençage du génome entier: Figure 1, » par OpenStax College, Biologie).,
étapes de séquençage de Sanger
la méthode de séquençage de Sanger comprend 6 étapes:
(1) l’ADN double brin (adnsd) est dénaturé en deux ADN simple brin (adnsd).
(2) une amorce qui correspond à une extrémité de la séquence est attachée.
(3) quatre solutions de polymérase avec quatre types de dNTP mais un seul type de ddNTP sont ajoutées.
(4) la réaction de synthèse de L’ADN commence et la chaîne s’étend jusqu’à ce qu’un nucléotide de terminaison soit incorporé de manière aléatoire.
(5) les fragments d’ADN résultants sont dénaturés en adnss.,
(6) les fragments dénaturés sont séparés par électrophorèse sur gel et la séquence est déterminée.
Figure 2. La méthode de séquençage Sanger en 6 étapes (adaptée de Gauthier 2008).