CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by alternative splicing or exon deletion

Nous avons récemment utilisé CRISPR pour perturber L’oncogène Kras dans deux lignées cellulaires indépendantes d’adénocarcinome pulmonaire , qui ont été dérivées de souris Kras G12D; p53 fl/fl (KP). Nous avons isolé deux clones unicellulaires portant chacun des suppressions de frameshifting dans l’exon 2 (Fig., 1A ET fichier supplémentaire 1: Figure S1a): KP1 porte une suppression de 2 nt « -CG” dans L’allèle G12D et une suppression de 1 nt « – C” dans l’allèle Kras de type sauvage (WT); et KP2 porte une suppression de 2 nt « -GG”. Aucun clone ne produit de protéine Kras pleine longueur, ce qui indique que les trois suppressions perturbent le cadre de lecture Kras.

Les mutations Frameshift dans les premiers exons sont connues pour déclencher une désintégration Non-sensée (NMD) , qui élimine les ARNm avec des codons de terminaison prématurée. Cependant, lorsque nous avons analysé les données de séquençage de l’ARNm (ARN-seq), nous avons constaté que les niveaux d’ARNm Kras apparents (c’est-à-dire les lectures d’ARNm normalisées totales) n’étaient réduits que de 19% dans les cellules KP1 et de 47% dans les cellules KP2, par rapport aux cellules KP parentales (Fig. 1b). Les deux clones ont produit moins de lectures d’exon 2, mais des niveaux normaux de lectures d’exon 1 et 3 (Fig., 1c), suggérant que l’exon 2 pourrait être ignoré dans les clones KP1 et KP2. En effet, nous avons détecté des lectures de jonction de l’exon 1-3, indiquant que l’exon 2 a été ignoré (Fig. 1C et fichier supplémentaire 1: Figure S1b). En calculant le rapport entre les lectures de l’exon 2 et les lectures totales, nous avons constaté que l’exon 2 n’est inclus que dans 64,0 ± 9,1% des lectures de Kras du clone KP1 (Fig. 1c et tableau 1). Un saut similaire de l’exon 2 a été observé chez les clones KP2 (fichier supplémentaire 1: Figure S1c)., De manière concordante, la transcription inverse de L’ARNm de Kras suivie d’une réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR) a donné deux produits: l’un correspondait à L’ADN complémentaire de Kras intact (ADNc) et l’autre correspondait à l’isoforme de l’exon 1-3 (Fig. 1d). L’isoforme de l’exon 1-3 conserve un cadre de lecture ouvert partiel de Kras qui pourrait initier la traduction d’un codon ATG dans l’exon 3 (Fichier supplémentaire 1: Figure S2) et produire une protéine Kras sévèrement tronquée.,

L’édition de Kras n’a pas induit d’épissage alternatif à l’échelle du génome. Nous avons identifié 97 exons épissés alternativement dans les cellules KP1 et 177 événements dans les cellules KP2. Les clones KP1 et KP2 ont partagé 22 événements d’inclusion ou d’exclusion de cassette, L’exclusion de L’exon 2 de Kras étant le plus grand changement dans les deux clones (Fig. 1e Et fichier supplémentaire 1: Tableau S3). Ainsi, l’édition de L’exon 2 de Kras a spécifiquement induit le saut de L’exon 2 de Kras., Notamment, alors que les transcriptions de Kras g12d de souris (GGU à GAU) ne sautent pas l’exon 2 dans les cellules KP parentales, nous avons constaté qu’environ 15% des transcriptions de KRAS G12S humains (codon 12 GGU à AGU) sautent l’exon 2 dans la lignée de cellules cancéreuses du poumon humain A549 (fichier supplémentaire 1: Figure S1d). Nous n’avons pas pu prédire le gain ou la perte d’amplificateurs ou de silencieux d’épissure d’exons , mais nos données suggèrent que les séquences près du codon 12 de Kras favorisent l’inclusion de l’exon 2 dans les Kras de souris et d’humains. Le saut d’Exon induit par L’édition CRISPR n’était pas limité aux Kras ou aux cellules KP de souris., Une étude récente a montré que L’édition CRISPR de L’exon 3 FLOT1 dans les cellules HeLa peut provoquer le saut de l’exon 3, de l’exon 4 ou des exons 3, 4 et 5 . Nous avons également détecté un saut d’exon Peu fréquent lorsque nous avons ciblé l’exon 11 de LMNA dans des cellules HCT116 humaines (fichier supplémentaire 1: Figure S3). Sauter L’exon 11 de L’ARNm produit une transcription dans le cadre qui pourrait être traduite en une protéine néomorphe.

pour explorer davantage l’idée que le saut d’exon pourrait produire une transcription fonctionnelle dans le cadre, nous avons demandé si L’édition par CRISPR de L’exon 3 Ctnnb1 pourrait induire le saut d’exon et provoquer un phénotype de gain de fonction., L’Exon 3 de Ctnnb1 code des résidus phosphoaccepteurs qui favorisent la dégradation du facteur de transcription β-caténine ; l’excision génétique de Ctnnb1 exon 3—qui est dans le cadre avec l’exon 4—stabilise une β-caténine constitutivement active qui s’accumule dans le noyau . Nous avons conçu 11 sgrna qui ciblent des régions le long de L’exon 3 Ctnnb1 (Ctnnb1-sg1 à-sg11), transduit des sgrna individuels dans des cellules KP et utilisé un séquençage à haut débit pour analyser l’étendue de l’édition au site cible sgRNA dans chaque ligne (Fig. 2B axe x, Fichier supplémentaire 1: Figure S4 et fichier supplémentaire 2: Tableau S4)., Trois sgrna (sg6, sg9 et sg10) ont ciblé de manière inefficace Ctnnb1. Huit des sgrna Ctnnb1 (sg1 à sg5, sg7, sg8 et sg11), cependant, ont induit des indels à leurs sites cibles avec des fréquences supérieures à 20%. Par exemple, Ctnnb1-sg1 a généré des insertions + T dans environ 65% des lectures (Fig. 2c). Dans chaque population ciblée par un fort sgRNA Ctnnb1, nous avons détecté trois produits RT-PCR couvrant les exons 2 à 5 (Fig. 2d). Le produit principal correspond à la transcription normalement épissée qui comprend l’exon 3. Les deux autres produits correspondent à des transcriptions alternativement épissées: un qui ignore l’exon 3 (c’est-à-dire, exon 2-4 épissage, fig. 2e) et un qui saute les deux exons 3 et 4 (c’est-à-dire l’épissage des exons 2-5, Fig. 2f). Ctnnb1 sgrnas ciblant soit le saut d’exon induit par le brin D’ADN et L’activité nucléase Cas9 était essentielle pour le saut d’exon (Fig. 3a).

L’analyse Western blot a révélé que les populations cellulaires transductées avec les sgrna puissants produisent une protéine β-caténine plus petite ~74 kD qui correspond en taille à celle attendue du produit d’épissure de l’exon 2-4 (Fig. 2g). La protéine β-caténine sur toute sa longueur n’a pas été significativement appauvrie quatre jours après la transduction. Pour vérifier si l’épissage alternatif dépend de L’expression continue de Cas9 ou de sgRNA dans les vecteurs lentiviraux, nous avons co-transfecté Cas9 et Ctnnb1-sg1 ou un témoin sgRNA non ciblé., Sept jours après la transfection, lorsque le Cas9 transfecté et les ARN guides devraient être épuisés, nous avons examiné la localisation de la β-caténine par immunofluorescence. Dans les cellules de fibroblastes de souris transfectées avec un contrôle non ciblant sgRNA, la β-caténine localisée aux jonctions cellulaires (fichier supplémentaire 1: Figure S5a). En revanche, dans de nombreuses cellules transfectées avec Ctnnb1-sg1, nous avons détecté de la β-caténine dans le noyau (fichier supplémentaire 1: Figure S5a)., Ces résultats suggèrent que l’édition continue n’est pas nécessaire pour le saut d’exon et que le saut d’exon 3 induit par L’édition médiée par CRISPR de L’exon 3 Ctnnb1 produit un gain de fonction isoforme β-caténine.

Nous avons analysé plus en détail les transcriptions couvrant les exons 2 à 7 dans des populations cellulaires traitées avec Ctnnb1-sg2, -sg3 et-sg5. En plus de l’isoforme pleine longueur, nous avons détecté quatre transcriptions avec l’exon 2 apparemment épissé à chaque exon en aval (exon 2-4, exon 2-5, exon 2-6 et exon 2-7; Fig. 3 bis, b)., Nous ne comprenons pas le mécanisme de ce saut d’exon apparemment promiscuité induit par L’édition de L’exon 3 Ctnnb1, et nous n’avons pas été en mesure de corréler le saut d’exon promiscueux avec des sites cibles spécifiques ou des mutations indel dans l’exon 3. Néanmoins, nous avons isolé un clone édité Ctnnb1-sg3 qui suggère un mécanisme potentiel (fichier supplémentaire 1: Figure S6a). Ce clone biallélique contient une suppression in-frame de 3 PB sur un allèle et une grande suppression de 832 PB sur l’autre; la suppression de 832 PB fusionne l’extrémité 5’ de l’intron 2 à l’extrémité 3’ de l’exon 4 (Fichier supplémentaire 1: Figure S6)., Nous avons détecté deux transcriptions dans ces cellules: la transcription correctement épissée qui inclut la suppression de 3-bp et une transcription qui inclut l’intron 2 fusionné à l’exon 4 (Fichier supplémentaire 1: Figure S6c et tableau 1). Ces résultats suggèrent que le saut apparent d’exons détecté dans des populations de cellules modifiées pourrait refléter des réarrangements du génome qui éliminent les exons.

deux expériences soutiennent l’idée qu’un seul sgRNA peut induire de grandes délétions génomiques qui éliminent les exons., Par exemple, nous avons isolé 15 clones de cellules 3T3 de souris transfectées transitoirement avec Cas9 et Ctnnb1-sg1, et avons constaté que quatre clones (c.-à-d. les clones 4, 5, 13 et 15) montraient un saut d’exon apparent par RT-PCR. La PCR génomique a révélé des réarrangements du génome dans trois de ces clones: des délétions importantes (>500 PB) et des délétions plus petites (~100 pb) dans les clones 4 et 15, et des insertions importantes dans les clones 13 et 15 (fichier supplémentaire 1: Figure S7)., De plus, après avoir ciblé l’exon 6 de p65 / RelA, nous avons isolé un clone biallélique p65 (#15): un allèle possède une insertion 1-nt « +A” et l’autre une suppression 2268-bp qui supprime les exons 5, 6 et 7 (Fichier supplémentaire 1: Figure S8a, c–e). Dans le clone p65 # 15, nous avons détecté la transcription entièrement épissée et un produit d’épissure exon 4-8 (fichier supplémentaire 1: Figure S8c). Les deux allèles codent des transcriptions à décalage de trame et les deux transcriptions p65 sont présentes à des niveaux inférieurs à WT (fichier supplémentaire 1: Figure S8b)., Nous avons également isolé un clone P65 Modifié (#31) homozygote pour la même insertion + A que dans le clone #15, mais le clone #31 ne produit pas de transcriptions épissées alternativement. Ainsi, la transcription épissée de l’exon 4-8 dans le clone #15 résulte de la suppression des exons 5, 6 et 7. Ces grands événements de suppression d’exons étaient inattendus et seraient manqués en utilisant des tests de dépistage par PCR typiques.,

la capacité de provoquer une activité de gain de fonction en induisant le saut d’exon ou l’excision d’exon a suggéré que L’édition méditée par CRISPR à l’aide d’un seul sgRNA pourrait être un moyen utile de sauver partiellement la fonction d’un gène de la maladie qui nécessite un sauvetage de bas niveau. La réparation de L’ADN homologue médiée par CRISPR a été utilisée pour corriger les mutations prématurées du codon d’arrêt dans le gène Dmd dans un modèle murin de DMD et plusieurs groupes ont utilisé CRISPR pour supprimer les exons Dmd et restaurer partiellement l’expression Dmd . Nous avons conçu quatre lentivirus sgRNA / Cas9 qui ciblent différents sites dans l’exon 23 du gène Dmd (Fig., 4A, b) et des myoblastes de souris C2C12, une lignée cellulaire largement utilisée comme modèle pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) . Dans des cellules C2C12 transductées avec des sgrna Dmd, nous avons détecté un produit RT-PCR qui correspond au produit d’épissure normal contenant l’exon 23. Le séquençage de ces produits RT-PCR a révélé que seul le Dmd-sg2 éditait efficacement L’exon 23 de la Dmd, comme en témoignent les pics de séquence mixtes au-delà du site cible du sgRNA (fichier supplémentaire 1: Figure S9). Dans des cellules transductées avec Dmd-sg2, nous avons également détecté un produit RT-PCR correspondant à l’exon 22 épissé à l’exon 24 (Fig. 4c, d)., Ainsi, le ciblage de l’exon 23 avec un sgRNA pourrait être suffisant pour induire un saut d’exon partiel et produire un cadre de lecture ouvert de dystrophine intact. La DMD est un exemple classique d’une maladie dans laquelle une petite quantité de restauration fonctionnelle peut fournir un bénéfice clinique substantiel .