Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174-deficient mice-blev genereret af standard gen-procedurer rettet mod at erstatte den Gpr174 open reading frame med en LacZ/neo kassette hjælp 129SvEvBrd embryonale stamceller linje (Texas&M Institut for Genomisk Medicin, TG0128). Disse gpr174-mangelfulde mus blev tilbagekrydset til C57BL / 6 mus i 12 generationer. Relevante mus på C57BL / 6-baggrunden blev interbred for at opnå GFP-udtrykkende MD4-mus og dsRed-udtrykkende GPR174-tilstrækkelige eller mangelfulde MD4-mus., Alder-matchede kuldkammerater mellem 6 og 12 uger og af de angivne køn blev brugt til forsøg. Prøvestørrelser for museksperimenter blev empirisk bestemt, og mus blev tilfældigt tildelt til kontrol eller eksperimentel gruppe. Ingen blinding var nødvendig for de museksperimenter, der blev præsenteret her. Alle mus blev opretholdt under specifikke patogenfrie forhold og blev brugt i overensstemmelse med statslige og Tsinghua institutionelle retningslinjer for dyrepleje og Brugsudvalg for dyrevelfærd.,
GPR174–GFP BAC transgene mus
Sekvenser, der koder for de glycin–glycin–glycin–serin (GGGS) linker (gentaget fire gange) og øget GFP (EGFP) blev indsat umiddelbart før stop codon af GPR174 open reading frame i mus BAC klon RP23-206J14 af homolog rekombination. Den modificerede BAC blev renset og mikroinjekteret i pronuclei af befrugtede æg for at generere transgene journalister. En grundlæggermus, der blev screenet positivt for GFP-udtrykkende B–celler i blodet, blev brugt til yderligere at opdrætte med B6-mus for at etablere gpr174-GFP BAC-stammen.,
cellekultur, retrovirus og in vitro transduktion
Naive T-celler eller B-celler blev isoleret under anvendelse af det Negative CD4 T-celle Isolationssæt eller det Naive B-celle Isolationssæt (Miltenyi Biotec) i henhold til producentens protokoller. At overexpress target gener i B-celler, renset B-celler blev aktiveret med 1 µg ml−1 lipopolysaccharide (Sigma), for 1 dag før at blive spin-inficeret med retroviral supernatanterne 1500 g 2 h, som described18.
konstruktion af knoglemarv chimaeras
B6 recipient mus blev dødeligt bestrålet med røntgen (5.,5 Gy, to gange) og derefter givet en intravenøs overførsel af 3 106 106 se.-matchede knoglemarvsceller, bestående af 80% µMT-celler og 20% GPR174-tilstrækkelige eller mangelfulde celler. Chimaeras blev anvendt til forsøg seks til otte uger efter rekonstitution.
Gonadectomy
Mus efter fravænning blev anaesthetized med avertin (2.5%, 0.015 ml g−1 kropsvægt) intraperitoneally. Til ovariektomi af hunmus blev æggestokke på begge sider udsat og fjernet gennem bilaterale dorsale indsnit., Til orkidektomi hos hanmus blev der foretaget en median abdominal snit for at udsætte og fjerne testikler på begge sider. Sham-opererede kontrolmus gennemgik kirurgi inklusive bilaterale dorsale snit eller en median abdominal snit uden fjernelse af æggestokke eller testikler. Kirurgiske såråbninger blev syet, og antibiotika og analgetika blev påført lokalt. Mus fik lov til at komme sig i otte uger før efterfølgende forsøg.,
Testosteron behandling
Seks – til otte-ugers-gamle mus var subkutant indsprøjtning med testosteron (10 mg kg−1 kropsvægt) opløst i solsikkeolie hver anden dag i to uger. Vehicle control mus blev behandlet med solsikkefrøolie alene.
Adoptiv overførsel, immunisering og viral infektion
At måle germinal-center dannelsen af MD4 B-celler, 105 OT-II-T-celler og 5 × 105 MD4 B-celler angivet af genotyper var intravenøst overføres til mandlige B6 modtagere, som efterfølgende blev immuniseret subkutant med 0.,5 µg lipopolysaccharid og 30 conjugg hel-OVA konjugatantigen i alun (Thermo Scientific). HEL-OVA blev fremstillet ved kemisk tværbinding med et HydraLink-konjugationssæt (SoluLink) som tidligere beskrevet 19. Til at måle germinal-center dannelse i svar til SRBC immunisering eller lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) infektion, mus blev intraperitoneal injektion med 5 × 108 SRBCs (fra Z. lipotes vexillifer) eller 2 × 105 plak-dannende enheder af LCMV Armstrong virus (fra L. I og R. Ahmed).,
EAE af MOG protein immunisering
Den sekvens, der koder for den første 120 aminosyrer af menneskelige MOG blev forstærket ved polymerase chain reaction (PCR) fra en menneskelig hjerne komplementære DNA-bibliotek, og klonede mellem NdeI og XhoI steder i pET22b+ udtryk vektor (Novagen). Humant MOG-protein blev udtrykt i BL21 (DE3) Escherichia coli og renset ved dets Carbo .y-terminale histidin (His) tag. Protein renhed og koncentration blev vurderet ved SDS–Page og bicinchoninsyre (BCA) protein assay, hhv. Rekombinante proteiner blev opbevaret ved -80 C C indtil brug., For at inducere EAE blev knoglemarv-kimære dyr af indikerede typer immuniseret subkutant ved flanken med 200 µg rekombinant humant MOG-protein emulgeret i komplet Freunds adjuvans på dag 0. Mus blev injiceret intravenøst med 200 ng pertussis-toksin (Invitrogen) på dag 0 og 2. Mus blev overvåget dagligt på en blind måde for sygdomsprogression fra dag 1. Sygdommens sværhedsgrad blev scoret som følgende: 0, ingen kliniske tegn; 1, lammet hale; 2, tab af koordineret bevægelse og pareser af bagbenene; 2.5, lammelse af det ene bagben lemmer; 3, lammelse af begge bagben; 3.,5, lammelse af begge bagben og svaghed i forbenene; 4, lammelse af forbenene; og 5, moribund. For at sammenligne sygdommens sværhedsgrad studerede vi ti mus pr.tilstand pr. eksperiment og analyserede sygdomsscorer over tid med tovejs ANOVA.
flowcytometri
Måling af antigen-specifikt antistof titres
At måle SRBC-specifikt antistof titres, vi lyseret 5 × 108 SRBCs med 1 ml dobbelt-destilleret vand og centrifugeres dem til 15.000 r.s.m. for 20 min., Pillen blev resuspenderet i PBS og bruges til frakke MaxiSorp enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plader (Nunc Maxisorp) natten over ved 4 °C. for At måle MOG-specifikke serum antistoffer, vi brugte 2 µg ml−1 renset rekombinant human MOG til pels ELISA-plader. Uspecifik binding blev blokeret med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS med Tween-20 (PBST) i 2 timer ved 37 °C, efterfulgt af inkubation med 2× serielle fortyndinger af serum prøver af immuniseret mus i 1 time ved 37 °C., Pladerne blev vasket og inkuberes med peberrod peroxidase (HRP) konjugeret anti-mus IgG-sekundært antistof (1/20,000) i 1 time ved 37 °C. Pladerne blev vasket, der er udviklet med 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB), og stoppede med 1 M HCl. Vi satte tomme brønde som nul og registrerede absorbans ved 450 nm. Vi brugte sera fra uimmuniserede mus som den negative kontrol; afskæringsværdien var den optiske densitet ved 450 nm (OD450) af den negative kontrol ganget med 2, 1. En brønd med en OD450-værdi på ikke mindre end afskæringsværdien blev betragtet som positiv., Den højeste fortynding af en prøve, der gav positivitet, er prøvens titer.
Fordeling af B-celler ved immunhistokemi
For forskellige eksperimenter, naive B-celler, B-celler aktiveres til 1 h med 10 µg ml−1 F(ab’)2 ged anti-mus IgM (Jackson Immunoresearch), eller B-celler transduced med retrovirus blev overført til B6 modtagere. Når det er påkrævet, at disse celler var mærket med 1 µM tetramethylrhodamine (TAMRA), 4-chloromethyl-6,8-difluor-7-hydroxycoumarin (CMF2HC) eller 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) (Invitrogen)., Milt eller lyskebrok lymfeknuder på modtageren mus blev fast med 1% paraformaldehyd i 12 timer og derefter tørret i 30% saccharose løsning for 12 h ved 4 °C. for At sikre størst mulig repræsentation af forskellige orgel regioner i det endelige datasæt, vi behandles vilkårlige vævssnit og farvet dem med angivet antistoffer. Farvningsreagenser i prisen eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), kanin anti-GFP (abcam), og AF488 gede-anti-kanin-IgG (Invitrogen)., Objektglas blev monteret med ProlongGold Antifade reagens (Invitrogen) og undersøgt med et Olympus FV1000 opretstående mikroskop. Billeder blev analyseret med Imaris (Bitplane) og ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
Miltstroma-præparat
milt fra mus, rotter eller svin blev gentagne gange presset og formalet mod et metalnet for at frigive røde blodlegemer og lymfocytter. De resterende ususpendable, amorfe stromale vævselementer blev grundigt vasket med PBS, inden de blev anbragt i B27 serumfrit dyrkningsmedium (Invitrogen) og inkuberet ved 37.C i 12 timer., For mus blev stromale elementer fra tre dyr dyrket i 1 ml medium. Til svin blev stromale elementer fra 1 milt dyrket i 80 ml. Den resulterende kultur blev centrifugeret ved 10.000 RPM i 60 minutter for at opnå det konditionerede medium, som enten straks blev anvendt til forsøg eller frosset ved -20 C C indtil brug.
Trans .ell assay
b−celler aktiveret med 1 µg ml-1 lipopolysaccharid i 60 timer blev anvendt til at assayere forskellige fraktioner som følge af biokemisk fraktionering., Naive B-celler og B-celler aktiveres med 10 µg ml−1 F(ab’)2 ged anti-mus IgM (Jackson Immunoresearch) og 10 µg ml−1 anti-CD40 (klon FGK4.5, Bio X-Celle) blev anvendt til analyse CCL21-induceret migration. Når B-celler af forskellige genotyper blev sammenlignet, blev mindst tre donormus af hver genotype og behandling brugt til at isolere B-celler i hvert forsøg, og kuldkammerater blev altid brugt. B-celler blev suspenderet ved 106 celler pr. milliliter og hvilede i RPMI-medium indeholdende 1% FBS ved 37.C i 1 time., Næste i alt 100 µl celle suspension blev tilføjet til det øverste kammer i 5 µm-pore Transwell (Corning Costar), og i alt 150 µl lokkemiddel-holdige løsninger blev tilføjet til bunden afdeling. Disse løsninger kultur medium samt med rå mus splenic stroma forberedelse, kultur, medie, samt med rå svin splenic stroma forberedelse, eluering af fraktioner fra kromatografi, kultur medium, der indeholder rekombinant CCL21 og CCL19 (Peprotech), eller 18/0 LysoPS (Avanti Polære Lipider) af de angivne koncentrationer., For nogle eksperimenter, murine stroma med aircondition medium først blev suppleret med en endelig koncentration på 5 µg ml−1 neutraliserende antistoffer mod mus CCL21 eller CCL19 (R&D system) eller ged IgG isotype kontrol, og inkuberes ved 4 °C i 3 timer, inden den anvendes til transwell analysen. Antistofdosis var mindst tilstrækkelig til at neutralisere 100 ng ml−1 CCL21 eller CCL19, som bestemt i foreløbige forsøg. Celler fik lov til at transmigrere i 3 timer ved 37.C i en inkubator., Celler, der var udvandret til bunden brønde blev optalt ved flow-cytometri, med fluorescerende A20 celler af kendte tal indsættes umiddelbart før læsning som en intern optælling standard. Hver betingelse blev målt i tre eksemplarer brønde, medmindre andet er angivet.
Biokemiske fraktionering
Kromatografi blev udført med et ÄKTApurifer 10 fast protein liquid chromatography (FPLC) system (GE Healthcare) ved 4 °C, med undtagelse af det sidste skridt, som blev udført med et ÄKTAmicro FPLC-system (GE Healthcare)., I alt 1.200 ml svinestroma-konditioneret medium blev påført en anionbytningssøjle (250 ml lejevolumen) ækvilibreret med buffer i (25 mM Hepes, pH 7,0). Kolonnen blev vasket med tre kolonnevolumener, før den blev elueret med tre kolonnevolumener af buffer i suppleret med 1 M NaCl. Den flow-through var buffer-ændret med buffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8.5) i 100 ml og genanvendes til en anion-udveksling kolonne bringes i ligevægt med buffer II. Kolonnen blev vasket med to kolonner mængder af buffer II og elueres med to kolonner mængder på 0,1–0,5 M lineære NaCl gradient., Fraktioner på hver 10 ml blev opsamlet, og alikvoter blev buffer-ændret med RPMI 1640 for Trans .ell assayet. Aktive fraktioner blev samlet og buffer-ændret til 10 ml med buffer II og lægges på en heparin kolonne (5 ml bed volumen) bringes i ligevægt med buffer II. Kolonnen blev vasket med 12 kolonne mængder af buffer II og elueres med 4 kolonne mængder af 0-2 M lineære NaCl gradient. Fraktioner på hver 2 ml blev opsamlet, og alikvoter blev buffer-ændret med RPMI 1640 til Trans .ell-assayet. Aktive fraktioner blev igen poolet, buffer-ændret til 0.,5 ml buffer jeg og lægges på en Superdex-75 kolonne (24 ml bed volumen) bringes i ligevægt med buffer I. Den kolonne, derefter blev elueret med en kolonne mængden af buffer I. Fraktioner af 0,5 ml hver blev indsamlet, og aliquoter, der var buffer-ændret med RPMI 1640 for transwell analysen. Aktive fraktioner blev samlet og koncentreret i 0,5 ml til at indlæse på en Mono S kolonne (1 ml bed volumen) bringes i ligevægt med buffer I. Den kolonne, der blev vasket med 12 kolonne mængder af buffer og jeg elueret med 25 kolonne mængder af 0-0.5 M lineære NaCl gradient., Fraktioner på 1 ml hver blev opsamlet, og alikvoter blev buffer-ændret med RPMI 1640 for Trans .ell assayet. Aktive fraktioner blev samlet, buffer-ændret og koncentreret i 50 µl med buffer jeg, og genindlæses på Mono S kolonne bringes i ligevægt med buffer I. Den kolonne, der blev vasket med tre kolonne mængder af buffer jeg indeholdende 0,3 M NaCl, og elueres med 24 kolonne mængder af 0,3–0,4 M lineære NaCl gradient., Fraktioner på 1 ml hver blev opsamlet, og alikvoter blev buffer-ændret med RPMI 1640 til den endelige trans .ell-assay for at identificere den fraktion, der indeholdt den stærkeste kemoattraktantaktivitet.
massespektrometri analyse
fraktioner fra det sidste rensningstrin blev koncentreret til 50 µl og analyseret på 12% NuPAGE geler (Invitrogen). Geler blev farvet med Pierce silver stain til massespektrometri (Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens protokol., Bånd med øgede intensiteter i fraktionen indeholdende den stærkeste kemoattraktantaktivitet blev udskåret og underkastet in-gel-fordøjelse, før de blev analyseret med et Exac e .active hf massespektrometer (Thermo Fisher Scientific). Massespektrometri data blev analyseret ved hjælp af S .issprot databasen med maskot søgemaskine.
Hans-mærkede rekombinant CCL21 og bindende analysen
musen CCL21 kodende sekvens blev forstærket af C57BL/6 mus milt cDNA og klonede mellem NdeI og XhoI steder i pET22b+ udtryk vektor (Novagen), som giver en C-terminal Hans tag., Det rekombinante protein blev udtrykt i bl21 (DE3) mus og renset ved dets mærke. Protein renhed og koncentration blev vurderet ved SDS–Page og BCA assay, henholdsvis, og bioaktivitet blev verificeret ved anvendelse af en calcium mobilisering assay. Rekombinante proteiner blev opbevaret ved -80 C C indtil brug. Til at måle CCL21–Hans binding til GPR174, med CCR7 som en positiv kontrol, 293T celler var transfected med GPR174–GFP eller CCR7–GFP fusion konstruktioner., Alikvoter af transficerede celler blev derefter inkuberet med CCL21–hans protein ved angivne koncentrationer ved 37.C i 30 minutter, vasket to gange med kold PBS og fikseret straks med 4% paraformaldehyd. Efter vask i PBS, faste celler blev farvet med et phycoerythrin-konjugeret anti-Hans antistof (klon J095G46, Biolegend) og analyseret ved flow-cytometri., GFP-celler i hver prøve tjente som en uspecifik baggrundsfarvning intern kontrol, og den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af GFP+ celler farvet med phycoerythrin-konjugeret anti-his antistof, med MFI af tilsvarende GFP− celler subtraheret, blev brugt til at kvantificere specifik CCL21-binding.
måling af kemokin-udløste calciumfluxeser
mus Gpr174 og Ccr7 blev forstærket ved PCR og klonet ind i pRK5 plasmidet. HEK293T-celler blev transient transficeret med GPR174-udtrykkende, CCR7-udtrykkende eller kontrolplasmid., Cellerne blev fysisk løsnet fra kulturbeholderen 48 timer efter transfektion, vasket to gange med PBS og farves med 1 um Indo-1 (Invitrogen) i PBS ved 37 C C i 30 min. Efter at være blevet vasket to gange med PBS blev cellerne resuspenderet med Hanks’ balancerede saltopløsning (Invitrogen) indeholdende 25 mM Hepes og 1% FBS og opbevaret på is. Når de udsættes for chemokine stimulation, celler blev først bragt i en vand-parti ved 37 °C i 5 min. inkubation, og derefter vurderet på et LSR II-typen (BD Biosciences) at fastlægge baseline for unstimulated stat., Cellerne blev stimuleret med en koncentration serie af rekombinant CCL21 spænder fra 0,1 ng ml−1 til 10 µg ml−1. Celler ved hver tilstand blev kontinuerligt overvåget og registreret i 2 minutter. I slutningen blev ionomycin (Sigma) yderligere tilsat til prøven i en endelig koncentration på 1 µg ml−1, og prøven blev yderligere overvåget og registreret i 1 min. Indo-1(bundet)/Indo-1 (frie) forhold blev anvendt til at indikere intracellulære Ca2+ koncentrationer, som analyseret i Flo .jo (TreeStar). Den højeste Ca2 + – koncentration stimuleret af ionomycin blev anvendt som 100% til normalisering af calciumresponsen induceret af CCL21., EC50 blev estimeret i GraphPad ved at montere en ikke-lineær dosis–responskurve med tre parametre.
Immunoprecipitation og western blotting
nyligt isolerede musen B-celler fra GPR174–GFP BAC transgene mus blev aktiveret med 10 µg ml−1 F(ab’)2 ged anti-mus-og IgM-og 10 µg ml−1 anti-CD40 til 48 h. Disse aktiverede B-celler blev derefter ophængt i 2 × 107 celler per ml i RPMI medium, der indeholder 1% FBS, og venstre ubehandlet eller stimuleret med 300 ng ml−1 CCL21 ved 37 °C i 30 min. B-celler blev derefter straks lyseret i 1% NP-40 lysis buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glycerol og proteasehæmmere). Til immunpræcipitation af GFP-mærket GPR174 blev lysater på 108 B-celler inkuberet natten over med 20 µl GFP–Fældeperler (ChromoTek). Efter gentagne vask, immunoprecipitates blev elueret med inkubation i 0,2 M Glycin buffer (pH 3,0) for 10 min ved stuetemperatur, og derefter er neutraliseret med 1 M Tris-HCl (pH 8.5). Proteiner blev adskilt af SDS-PAGE og overført til polyvinylidenmembran (Millipore). Membraner blev blokeret med Tris-bufret saltvand indeholdende 5% BSA og 0,1% t .een 20., At opdage target-molekyler ved immunoblotting, vi har brugt kanin anti-GFP (Abcam), kanin anti-Gai-1 (Abcam), kanin anti-Gai-2 (Abcam) og kanin anti-Ga13 (Abcam) antistoffer. HRP-konjugeret ged anti-kanin antistof blev købt fra Bioeasytech. Immunoblots blev påvist ved hjælp af forbedret kemiluminescens (Thermo Fisher Scientific), og billeder blev analyseret med ImageJ soft .are.
Kvantitativ PCR
Celler i ønskede former, blev sorteret med en FACSAria III og udsat for total RNA ekstraktion med RNeasy Plus Mini eller Micro kit (Qiagen) i henhold til producentens instruktioner., RNA blev omvendt transkriberet med alt-i-en RT Mastermi. (Abm). Kvantitativ PCR blev udført med Abpcr Mastermi. (Abm) på et 7500 realtids-PCR-system (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., Relativ ekspression af målgener blandt forskellige prøver blev sammenlignet efter normalisering mod ekspression af husholdnings gener Actb eller Gapdh.
statistisk dataanalyse
statistik og grafer blev udført i Prism (Graphpad). Medmindre andet er angivet, blev to-tailed unpaired Students t-test brugt til at sammenligne endpoint midler fra forskellige grupper.
Rapporteringsoversigt
yderligere oplysninger om forskningsdesign er tilgængelige i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.