Hvad Er Sanger Sekventering?Sanger-sekventering, også kendt som” kædetermineringsmetoden”, blev udviklet af den engelske biokemiker Frederick Sanger og hans kolleger i 1977. Denne metode er designet til at bestemme sekvensen af nukleotidbaser i et stykke DNA (almindeligvis mindre end 1.000 bp i længden). Sanger sekventering med 99.,99% basenøjagtighed betragtes som “guldstandard” til validering af DNA-sekvenser, inklusive dem, der allerede er sekventeret gennem næste generations sekventering (NGS). Sanger-sekventering blev brugt i det humane genomprojekt til at bestemme sekvenserne af relativt små fragmenter af humant DNA (900 bp eller mindre). Disse fragmenter blev brugt til at samle større DNA-fragmenter og til sidst hele kromosomer.
Sanger sekventering VS NGS
udviklingen af NGS-teknologier har fremskyndet genomforskning. NGS kan samtidig sekvens mere end 100 gener og hele genomer med lavt input DNA., Sanger-sekventering er fortsat meget udbredt i den rækkefølge område, da det giver flere fremtrædende fordele: (i) omkostningseffektivitet for sekventering enkelt gener og (ii) 99.99% nøjagtighed, især velegnet til verifikation sekventering for site-directed mutagenese eller klonede skær.
hvordan virker Sanger sekventering?
i Sanger-sekventering bruges en DNA-primer, der komplementerer template-DNA ‘et (DNA’ et, der skal sekventeres), til at være et udgangspunkt for DNA-syntese., I nærvær af de fire deo .ynukleotidtriphosphater (dntps: A, G, C og T) udvider polymerasen primeren ved at tilsætte den komplementære dNTP til template-DNA-strengen. For at bestemme hvilket nukleotid der er inkorporeret i kæden af nukleotider, anvendes fire dideo .ynukleotidtriphosphater (ddntps: ddatp, ddGTP, ddCTP og ddTTP) mærket med et tydeligt fluorescerende farvestof til at afslutte syntesereaktionen. Sammenlignet med dNTPs har ddNTPs et O oxygenygenatom fjernet fra ribonucleotid, og kan derfor ikke danne en forbindelse med det næste nukleotid., Efter syntese indlæses reaktionsprodukterne i fire baner af en enkelt gel afhængigt af det forskellige kædeterminerende nukleotid og udsættes for gelelektroforese. Ifølge deres størrelser bestemmes sekvensen af DNA ‘ et således.
Figur 1. Strukturen af ddNTP og dNTP.
Billedkredit: “sekventering af hele genomet: Figur 1,” af Opensta.College, Biologi)., sanger-Sekventeringstrin
Sanger-sekventeringsmetoden består af 6 trin:
(1) det dobbeltstrengede DNA (dsDNA) denatureres i to enkeltstrengede DNA (ssdna).
(2) En primer, der svarer til den ene ende af sekvensen, er fastgjort.
(3) Fire polymeraseopløsninger med fire typer dNTP ‘ er, men kun en type ddNTP tilsættes.
(4) DNA-syntesereaktionen starter, og kæden strækker sig, indtil et termineringsnukleotid er tilfældigt inkorporeret.
(5) de resulterende DNA-fragmenter denatureres til ssdna.,
(6) de denaturerede fragmenter adskilles ved gelelektroforese, og sekvensen bestemmes.
Figur 2. Sanger sekventeringsmetoden i 6 trin (tilpasset fra Gauthier 2008).