CRISPR/Cas9-medieret genom-redigering inducerer exon at springe ved alternativ splejsning eller exon sletning

Vi har brugt for nylig CRISPR at forstyrre Kras-onkogenet i to uafhængige lunge adenocarcinoma cellelinjer , der stammer fra Kras G12D; p53 fl/fl (KP) mus . Vi isolerede to enkeltcellekloner, der hver bærer rammeskiftende sletninger i e .on 2 (fig., 1a og Ekstra fil 1: Figur S1a): KP1 bærer en 2-nt “-CG” sletning i G12D allel og et 1-nt “-C” sletning i det ellers wild-type (WT) Kras-allel, og KP2 bærer en 2-nt “-GG” sletning. Ingen af klonerne producerer Kras-protein i fuld længde, hvilket indikerer, at alle tre sletninger forstyrrer Kras-læsningsrammen.

Frameshift-mutationer i begyndelsen af exons er kendt for at udløse nonsense-medieret decay (NMD) , som eliminerer mrna med for tidlig afslutning-codons. Da vi analyserede mRNA-sekventeringsdata (RNA-se.), fandt vi imidlertid, at tilsyneladende Kras-mRNA-niveauer (dvs. total normaliseret mRNA-læser) kun blev reduceret med 19% i KP1-celler og 47% i KP2-celler sammenlignet med forældrenes KP-celler (fig. 1b). Begge kloner producerede færre e .on 2 læser, men normale niveauer af e .on 1 og 3 læser (Fig., 1c), hvilket antyder, at e .on 2 muligvis springes over i KP1-og KP2-klonerne. Faktisk opdagede vi e .on 1-3 junction læser, hvilket indikerer, at e .on 2 blev sprunget over (Fig. 1c og yderligere fil 1: Figur S1b). Beregning af forholdet mellem exon 2 læser og læser alt, fandt vi, at exon 2 er indeholdt i kun 64.0 ± 9,1% af Kras læser fra KP1-klon (Fig. 1c og tabel 1). Lignende e .on 2 skipping blev observeret i KP2-kloner (yderligere fil 1: Figur S1c)., Concordantly, reverse transkription af Kras mRNA efterfulgt af polymerase chain reaction (RT-PCR) givet to produkter: en svarede at intakt Kras komplementære DNA (cDNA) og den anden svarede til den exon 1-3 isoform (Fig. 1d). Exon 1-3 isoform bevarer en delvis Kras open reading frame, som kunne iværksætte en oversættelse fra en ATG codon i exon 3 (Supplerende fil 1: Figur S2) og producerer et meget stort Kras protein.,

Redigering af Kras ikke fremkalde alternativ splejsning genome-wide. Vi identificerede 97 alternativt splejsede eksoner i KP1-celler og 177 begivenheder i KP2-celler. KP1 og KP2 kloner delte 22 kassette inklusion eller udelukkelse begivenheder, med udelukkelse af Kras e .on 2 er den største ændring i begge kloner (Fig. 1e og yderligere fil 1: tabel S3). Således inducerede redigering af Kras e .on 2 specifikt spring over Kras e .on 2., Bemærkelsesværdigt er det, der henviser til, at musen Kras G12D (GGU at GAU) udskrifter må ikke springe exon 2 i forældrenes KP celler, fandt vi, at ~15% af den menneskelige KRAS G12S (codon 12 GGU til AGU) afskrifter springe exon 2 i A549 menneskelige lunge cancer celle linje (Ekstra fil 1: Figur S1d). Vi var ude af stand til at forudsige den gevinst eller tab af exon splejse smagsforstærkere eller lyddæmpere , men vores data tyder på, at sekvenser i nærheden af Kras codon 12 fremme exon 2 inklusion i mus og mennesker Kras. E .on skipping induceret af CRISPR redigering var ikke begrænset til Kras eller mus KP celler., En nylig undersøgelse viste, at CRISPR redigering af FLOT1 exon 3 i HeLa celler kan forårsage springer af exon 3, exon 4, eller exons 3, 4 og 5 . Vi har også opdaget sjældne e .on springe når vi målrettet e .on 11 af LMNA i humane HCT116 celler (yderligere fil 1: Figur S3). Springe LMNA e .on 11 producerer en in-frame udskrift, der kunne oversættes til en neomorf protein.

til yderligere At udforske den idé, at exon skipping kunne producere en funktionel i-frame udskrift, spurgte vi, om CRISPR-medieret redigering af Ctnnb1 exon 3 kan fremkalde exon springe og forårsage en gain-of-function fænotype., Exon 3 af Ctnnb1 koder phosphoacceptor rester, der fremmer nedbrydningen af β-Catenin transskription faktor ; genetiske excision af Ctnnb1 exon 3—der er i rammen med exon 4—stabiliserer en constitutively aktiv β-Catenin, der ophobes i kernen . Vi har designet 11 sgRNAs, der er målrettet regioner, der findes langs Ctnnb1 exon 3 (Ctnnb1-sg1 til -sg11), transduced enkelte sgRNAs i KP celler, og brugt high-throughput-sekventering til at analysere omfanget af redigering på sgRNA target-site i hver linje (Fig. 2b axis-akse, yderligere fil 1: Figur S4 og yderligere fil 2: Tabel S4)., Tre sgrna ‘ er (sg6, sg9 og sg10) målrettede ctnnb1 ineffektivt. Otte af ctnnb1 sgRNAs (sg1 til sg5, sg7, sg8 og sg11) inducerede imidlertid indels på deres målsteder med frekvenser, der oversteg 20%. For eksempel genererede Ctnnb1-sg1 + T-indsættelser i omkring 65% af læsningerne (fig. 2c). I hver population, Der er målrettet mod en stærk ctnnb1 sgRNA, opdagede vi tre RT-PCR-produkter, der spænder over e .ons 2 til 5 (fig. 2d). Hovedproduktet svarer til det normalt splejsede transkript, der inkluderer e .on 3. De to andre produkter svarer til alternativt splejsede udskrifter: en, der springer over e 3ON 3 (dvs ., e 2-on 2-4 splejsning, Fig. 2e) og en, der springer både e andons 3 og 4 (dvs. e .on 2-5 splejsning, Fig. 2f). Ctnnb1 sgRNAs rettet mod enten DNA-strand induceret exon springe og Cas9 nuclease aktivitet, der var af afgørende betydning for exon skipping (Fig. 3a).

Western blot analyse viste, at cellepopulationer transduced med den stærke sgRNAs producere en mindre ~74 kD β-Catenin protein, der svarer i størrelse til den, der kan forventes fra exon 2-4 splejse produkt (Fig. 2g). Β-Cateninproteinet i fuld længde var ikke signifikant udtømt fire dage efter transduktion. Til at teste, om alternativ splejsning er afhængige af den fortsatte udtryk for Cas9 eller sgRNA i lentiviral vektorer, vi co-transfected Cas9 og Ctnnb1-sg1 eller en ikke-målrettet sgRNA kontrol., Syv dage efter transfektion, når transficeret Cas9 og guide RNA ‘ er skulle udtømmes, undersøgte vi β-Catenin lokalisering ved immunofluorescens. I mus fibroblastceller transficeret med en ikke-målretning kontrol sgRNA, β-Catenin lokaliseret til celle vejkryds (yderligere fil 1: Figur S5a). I modsætning hertil opdagede vi i mange celler, der blev transficeret med Ctnnb1-sg1, β-Catenin i kernen (yderligere fil 1: Figur S5a)., Disse resultater tyder på, at den kontinuerlige redigering er ikke påkrævet for exon at springe, og at exon 3 spring, der er fremkaldt af CRISPR-medieret redigering af Ctnnb1 exon 3 producerer en gain-of-function β-Catenin-isoformen.

vi analyserede yderligere transkripter, der spænder over e .oner 2 til 7 i cellepopulationer behandlet med ctnnb1-sg2,- sg3 og-sg5. Ud over den fulde længde isoform, vi har registreret fire udskrifter med exon 2 tilsyneladende splejset til hver downstream-exon (dvs exon 2-4, exon 2-5, exon 2-6, og exon 2-7; Fig. 3a, B)., Vi kan ikke forstå den mekanisme af dette tilsyneladende promiskuøs exon springe fremkaldt af Ctnnb1 exon 3 redigering, ej heller har vi været i stand til at korrelere promiskuøs exon at springe med specifikke mål websteder eller indel mutationer i exon 3. Ikke desto mindre isolerede vi en ctnnb1-sg3 redigeret klon, der antyder en potentiel mekanisme (yderligere fil 1: Figur S6a). Dette biallelic klon indeholder en 3-bp i-frame sletning på den ene allel, og en stor 832-bp deletion på den anden side; 832-bp deletion sikringer 5′ ende af intron 2 til 3′ – enden af exon 4 (Ekstra fil 1: Figur S6)., Vi opdagede to transkripter i disse celler: det korrekt splejsede transkript, der inkluderer sletningen af 3-bp og et transkript, der inkluderer intron 2 fusioneret til e .on 4 (Yderligere fil 1: Figur S6c og tabel 1). Disse resultater antyder, at tilsyneladende e .on-spring, der blev påvist i populationer af redigerede celler, kunne afspejle genomomlejringer, der fjerner e .oner.

to eksperimenter understøtter ideen om, at en enkelt sgRNA kan inducere store genomiske sletninger, der fjerner e .oner., For eksempel, vi isoleret 15 kloner fra mus 3T3 celler transient transfected med Cas9 og Ctnnb1-sg1, og fandt, at fire kloner (dvs kloner, 4, 5, 13 og 15) viste klart, exon at springe ved RT-PCR. Genomisk PCR afsløret genom-rearrangementer i tre af disse kloner: større deletioner (>500 bp) og mindre sletninger (~100 bp) i kloner 4 og 15, og store indførelser i kloner 13 og 15 (Ekstra fil 1: Figur S7)., Desuden, efter målretning exon 6 af p65/Forhold, vi isoleret en biallelic p65-klon (#15): en allel rummer en 1-nt+Et” indsættelse og den anden rummer en 2268-bp deletion, der fjerner exons 5, 6, og 7 (Ekstra fil 1: Figur S8a, c–e). I p65 klon # 15, vi opdaget den fuldt splejset udskrift og en e .on 4-8 splice produkt (yderligere fil 1: Figur S8c). Begge alleler indkode frameshifted udskrifter og begge p65 udskrifter er til stede på lavere niveauer end Figuret (yderligere fil 1: Figur S8b)., Vi har også isoleret en redigeret p65-klon (#31) homozygot for den samme + En indsættelse som i klon #15, men klon #31 ikke producerer alternativt splejset udskrifter. Således exon 4-8 splejset udskrift i klon #15 resultater fra sletning af exons 5, 6, og 7. Disse store e .on-sletningshændelser var uventede og ville blive savnet ved hjælp af typiske PCR-baserede screeningsassays.,

evnen til at forårsage en gain-of-function aktivitet ved at inducere exon spring eller exon excision foreslog, at CRISPR-mediterede redigering ved hjælp af en enkelt sgRNA kunne være en nyttig måde til delvist at redde funktion til en sygdom gen, der kræver lav-niveau redning. CRISPR-medieret homologe DNA-reparation har været anvendt til at korrigere for tidlig stop codon mutationer i Dmd-genet i en musemodel af DMD, og flere grupper har brugt CRISPR at slette Dmd exons og delvis genoprette Dmd udtryk . Vi designede fire sgRNA / Cas9 lentivirus, der er målrettet mod forskellige steder i E .on 23 af Dmd-genet (fig., 4a, B) og transduceret mus C2C12 myoblaster, en cellelinie, der i vid udstrækning anvendes som model for Duchenne muskeldystrofi (DMD). I c2c12-celler transduceret med Dmd sgrna ‘ er opdagede vi et RT-PCR-produkt, der svarer til det normale splejsningsprodukt indeholdende E .on 23. Sekventering af disse RT-PCR-produkter afslørede, at kun Dmd-sg2 effektivt redigerede Dmd e .on 23, hvilket fremgår af blandede sekvenstopper ud over sgRNA-målstedet (yderligere fil 1: Figur S9). I celler transduceret med Dmd-sg2 detekterede vi også et RT-PCR-produkt svarende til e .on 22 splejset til e .on 24 (fig. 4c, d)., Målretning mod e .on 23 med en sgRNA kan således være tilstrækkelig til at inducere delvis e .on-springning og producere en intakt dystrofin åben læseramme. DMD er et klassisk eksempel på en sygdom, hvor en lille mængde funktionel restaurering kan give betydelig klinisk fordel .