Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., Los ratones con deficiencia de GPR174 se generaron mediante procedimientos estándar de orientación genética para reemplazar el marco de lectura abierto Gpr174 con un casete LacZ / neo utilizando la línea de células madre embrionarias 129svevbrd (Texas a&M Institute for Genomic Medicine, TG0128). Estos ratones con deficiencia de GPR174 fueron retrocruzados a ratones C57BL / 6 durante 12 generaciones. Los ratones relevantes en el fondo de C57BL / 6 se cruzaron para obtener ratones MD4 que expresaban GFP y ratones MD4 que expresaban gpr174 suficientes o deficientes., Para los experimentos se utilizaron compañeros de camada de 6 a 12 semanas de edad y de los sexos indicados. Los tamaños de muestra para experimentos con ratones se determinaron empíricamente, y los ratones se asignaron aleatoriamente al grupo de control o experimental. No fue necesario cegar para los experimentos con ratones presentados aquí. Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos y se utilizaron de acuerdo con las directrices gubernamentales y del Comité de atención y uso de animales de Tsinghua para el bienestar animal.,
ratones transgénicos gpr174–GFP BAC
Las secuencias que codifican para el enlazador glicina–glicina–glicina–serina (GGGS) (repetido cuatro veces) y GFP mejorado (EGFP) se insertaron inmediatamente antes del codón de parada del marco de lectura abierto GPR174 en el clon de Bac de ratón RP23-206j14 por recombinación homóloga. El BAC modificado fue purificado y microinyectado en el pronúcleo de óvulos fertilizados para generar reporteros transgénicos. Un ratón fundador que fue examinado positivo para GFP expresando células B en la sangre se utilizó para reproducirse con ratones B6 para establecer la cepa GPR174–GFP BAC.,
se aislaron cultivos celulares, retrovirus y transducción in vitro
células T o células B Naive utilizando el kit de aislamiento de células T CD4 negativo o el kit de aislamiento de células B Naive (Miltenyi Biotec) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para sobreexpresar los genes diana en las células B, las células B purificadas se activaron con 1 µg ml−1 lipopolisacárido (Sigma) durante 1 día antes de ser espín-infectadas con sobrenadantes retrovirales a 1.500 g durante 2 h, como se describió18.
construcción de quimeras de médula ósea
Los ratones receptores de B6 fueron letalmente irradiados por rayos X (5.,5 Gy, dos veces) y luego se le administró una transferencia intravenosa de 3 × 106 células de médula ósea compatibles con el sexo, consistentes en 80% de células µMT y 20% de células suficientes o deficientes de GPR174. Las Quimeras se utilizaron para experimentos de seis a ocho semanas después de la reconstitución.
Gonadectomía
Los ratones después del destete fueron anestesiados con avertin (2,5%, 0,015 ml de peso corporal g−1) intraperitoneal. Para la ovariectomía de ratones hembra, los ovarios de ambos lados se expusieron y se extirparon a través de incisiones dorsales bilaterales., Para la orchidectomía en ratones machos, se realizó una incisión abdominal mediana para exponer y extirpar testículos en ambos lados. Los ratones control operados de forma simulada se sometieron a una cirugía que incluyó incisiones dorsales bilaterales o una incisión abdominal mediana sin extirpación de ovarios o testículos. Se suturaron las aberturas de las heridas quirúrgicas y se aplicaron antibióticos y analgésicos localmente. A los ratones se les permitió recuperarse durante ocho semanas antes de los experimentos posteriores.,
tratamiento con testosterona
Los ratones de seis a ocho semanas de edad fueron inyectados subcutáneamente con testosterona (10 mg kg−1 peso corporal) disuelta en aceite de semilla de girasol en días alternos durante dos semanas. Los ratones de control del vehículo fueron tratados con aceite de semilla de girasol solo.
transferencia adoptiva, inmunización e infección viral
para medir la formación del centro germinal por células MD4 B, 105 células T OT-II y 5 × 105 células MD4 B de los genotipos indicados fueron transferidos por vía intravenosa a receptores B6 masculinos, que posteriormente fueron inmunizados por vía subcutánea con 0.,5 µg de lipopolisacárido y 30 µg de antígeno conjugado HEL-OVA en alumbre (Thermo Scientific). El HEL-OVA se hizo mediante reticulación química con un kit de conjugación HydraLink (SoluLink) como se describió previamente19. Para medir la formación del centro germinal en respuesta a la inmunización de SRBC o la infección por el virus linfocítico de la coriomeningitis (LCMV), los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 5 × 108 SRBCs (de Z. Baiji) o 2 × 105 unidades formadoras de placa del lcmv Armstrong virus (de L. Ye y R. Ahmed).,
EAE by mog protein immunization
la secuencia que codifica los primeros 120 aminoácidos de MOG humano fue amplificada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una biblioteca de ADN complementario del cerebro humano, y clonada entre los sitios NdeI y XhoI del vector de expresión pET22b+ (Novagen). La proteína Mog humana fue expresada en BL21 (de3) Escherichia coli y purificada por su etiqueta de histidina carboxi-terminal (His). La pureza y la concentración de proteínas se evaluaron mediante el ensayo de proteína SDS-PAGE y del ácido biciconínico (BCA), respectivamente. Las proteínas recombinantes se conservaron a -80 °C hasta su utilización., Para inducir la EAE, los animales de médula ósea quimérica de los tipos indicados fueron inmunizados subcutáneamente en el flanco con 200 µg de proteína Mog humana recombinante emulsionada en adyuvante completo de Freund el día 0. Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 200 ng de toxina pertussis (Invitrogen) los días 0 y 2. Los ratones fueron monitorizados diariamente de manera ciega para la progresión de la enfermedad desde el día 1. La gravedad de la enfermedad se calificó de la siguiente manera: 0, sin signos clínicos; 1, Cola paralizada; 2, pérdida de movimiento coordinado y paresia de las extremidades posteriores; 2,5, parálisis de una extremidad posterior; 3, parálisis de ambas extremidades posteriores; 3.,5, parálisis de ambas extremidades posteriores y debilidad en los miembros delanteros; 4, parálisis de los miembros delanteros; y 5, moribundo. Para comparar la gravedad de la enfermedad, estudiamos diez ratones por enfermedad por experimento y analizamos las puntuaciones de la enfermedad a lo largo del tiempo con ANOVA bidireccional.
citometría de flujo
medición de títulos de anticuerpos específicos de antígeno
para medir títulos de anticuerpos específicos de SRBC, lisamos 5 × 108 SRBCs con 1 ml de agua doble destilada y los centrifugamos A 15,000 r.p.m. durante 20 min., El pellet se resuspendió en PBS y se usó para recubrir las placas de ensayo de inmunoabsorción enzimática (Elisa) de MaxiSorp (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4 °C. Para medir los anticuerpos séricos específicos de Mog, usamos 2 µg ml-1 de MOG humano recombinante purificado para recubrir las placas de ELISA. La Unión inespecífica se bloqueó con albúmina sérica bovina (ASC) al 1% en PBS con Tween-20 (PBST) durante 2 h a 37 °C, seguida de incubación con 2× diluciones seriadas de muestras séricas de ratones inmunizados durante 1 h a 37 °C., Las placas se lavaron e incubaron con anticuerpo secundario anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1/20.000) durante 1 h a 37 °C. Las placas se lavaron,se desarrollaron con 3,3′, 5,5′-tetrametilbencidina (TMB) y se detuvieron con 1 m de HCl. Fijamos pocillos en blanco como cero, y registramos absorbancia a 450 nm. Se utilizaron sueros de ratones no inmunizados como control negativo; el valor de corte fue la densidad óptica a 450 nm (OD450) del control negativo multiplicado por 2,1. Un pozo con un valor OD450 no inferior al valor de corte se consideró positivo., La mayor dilución de una muestra que dio positividad es el título de la muestra.
distribución de las células B por inmunohistoquímica
para diversos experimentos, se transfirieron a receptores B6 células B naive, células B activadas durante 1 h con 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat Anti-mouse IgM (Jackson Immunoresearch) o células B transducidas con retrovirus. Cuando fue necesario, estas células fueron marcadas con 1 µM de tetrametilrodamina (TAMRA), 4-clorometil-6,8-difluoro-7-hidroxicumarina (CMF2HC) o 5-clorometilfluoresceína diacetato (CMFDA) (Invitrogen)., Los bazos o ganglios linfáticos inguinales de los ratones receptores se fijaron con paraformaldehído al 1% durante 12 h y luego se deshidrataron en solución de sacarosa al 30% durante 12 h a 4 °C. para garantizar la máxima representación de las diferentes regiones orgánicas en el conjunto de datos final, procesamos secciones de tejido no consecutivas y las teñimos con los anticuerpos indicados. Los reactivos de tinción incluyeron eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), rabbit anti-GFP (abcam) y af488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen)., Los portaobjetos se montaron con el reactivo antifade ProlongGold (Invitrogen) y se examinaron con un microscopio vertical Olympus FV1000. Las imágenes fueron analizadas con Imaris (Bitplane) e ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
preparación de estroma esplénico
bazos de ratones, ratas o cerdos fueron presionados repetidamente y molidos contra una malla metálica para liberar glóbulos rojos y linfocitos. Los restantes elementos insospechables y amorfos del tejido estromal fueron lavados a fondo con PBS antes de ser colocados en medio de cultivo libre de suero B27 (Invitrogen) e incubados a 37 °C durante 12 h., Para los ratones, los elementos estromales de tres animales se cultivaron en medio de 1 ml. Para los cerdos, los elementos estromales de 1 bazo se cultivaron en 80 ml. El cultivo resultante se centrifugó a 10,000 r.p.m. durante 60 min para obtener el medio acondicionado, que se usó inmediatamente para experimentos o se congeló a -20 °C hasta su uso.
ensayo Transwell
Se utilizaron células B activadas con 1 µg ml−1 lipopolisacárido durante 60 h para analizar diferentes fracciones resultantes del fraccionamiento bioquímico., Se utilizaron células B Naive o células B activadas con 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat Anti-mouse IgM (Jackson Immunoresearch) y 10 µg ml−1 anti-CD40 (clon Fgk4.5, Bio X Cell) para evaluar la migración inducida por CCL21. Cuando se compararon células B de diferentes genotipos, se utilizaron al menos tres ratones donantes de cada genotipo y tratamiento para aislar células B en cada experimento, y siempre se utilizaron compañeros de camada. Las células B fueron suspendidas a 106 células por mililitro y reposaron en medio RPMI conteniendo 1% de FBS a 37 °C durante 1 h., A continuación, se añadió un total de 100 µl de suspensión celular a la cámara superior en un Transwell de 5 µm de poro (Corning Costar), y un total de 150 µl de soluciones que contienen atrayentes se añadieron a la cámara inferior. Estas soluciones incluyeron medio de cultivo acondicionado con preparación de estroma esplénico de ratón crudo, medio de cultivo acondicionado con preparación de estroma esplénico de cerdo crudo, fracciones de elución de cromatografía, medio de cultivo que contenía ccl21 y Ccl19 recombinantes (Peprotech) o 18/0 LysoPS (lípidos polares de Avanti) de las concentraciones indicadas., Para algunos experimentos, el medio condicionado por estroma Murino se suplementó primero con una concentración final de 5 µg ml−1 anticuerpos neutralizantes contra el ratón ccl21 o ccl19 (R&sistema D) o control del isotipo IgG de cabra, y se incubó a 4 °C durante 3 h antes de ser utilizado para el ensayo transwell. La dosis de anticuerpos fue al menos suficiente para neutralizar 100 ng ml−1 CCL21 o CCL19, según se determinó en experimentos preliminares. Las células se permite a trasmigrado durante 3 h a 37 °C en una incubadora., Las células que habían migrado a los pozos de fondo fueron enumeradas por citometría de flujo, con células fluorescentes A20 de números conocidos agregadas inmediatamente antes de la lectura como un estándar de conteo interno. Cada condición se midió en pocillos triplicados a menos que se indique lo contrario.
Fraccionamiento bioquímico
La cromatografía se realizó utilizando un sistema de cromatografía líquida de proteína rápida ÄKTApurifer 10 (FPLC) (GE Healthcare) a 4 °C, con la excepción del último paso, que se realizó utilizando un sistema de FPLC ÄKTAmicro (GE Healthcare)., Se aplicó un total de 1.200 ml de medio porcino estroma-condicionado a una columna de intercambio de aniones (volumen de lecho de 250 ml) equilibrada con tampón I (Hepes de 25 mM, pH 7,0). La columna fue lavada con tres volúmenes de la columna antes de ser eluida con tres volúmenes de la columna del almacenador intermediario complementé con 1 M NaCl. El flujo se cambió con buffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8.5) a 100 ml y se volvió a aplicar a una columna de intercambio de aniones equilibrada con buffer II. la columna se lavó con dos volúmenes de columna de buffer II y se eluyó con dos volúmenes de columna de un gradiente lineal de NaCl de 0.1-0.5 m., Se recogieron fracciones de 10 ml cada una, y se cambiaron las alícuotas con RPMI 1640 para el ensayo transwell. Las fracciones activas se agruparon y se cambiaron a 10 ml con buffer II y se cargaron en una columna de heparina (volumen de lecho de 5 ml) equilibrada con buffer II. La columna se lavó con 12 volúmenes de columna de buffer II y se elutó con 4 volúmenes de columna de gradiente lineal de NaCl de 0-2 M. Se recogieron fracciones de 2 ml cada una y se cambiaron las alícuotas con RPMI 1640 para el ensayo transwell. Las fracciones activas fueron agrupadas de nuevo, buffer-cambiado a 0.,5 ml de tampón I y cargado en una columna Superdex – 75 (volumen de lecho de 24 ml) equilibrada con tampón I. La columna se elutó con un volumen de una columna de tampón I. Se recogieron fracciones de 0,5 ml cada una, y se cambiaron las alícuotas de tampón con RPMI 1640 para el ensayo transwell. Las fracciones activas se agruparon y concentraron en 0,5 ml para cargar en una columna Mono S (volumen de lecho de 1 ml) equilibrada con tampón I. La columna se lavó con 12 volúmenes de tampón I y se elutó con 25 volúmenes de columna de gradiente lineal de NaCl de 0-0, 5 M., Se recogieron fracciones de 1 ml cada una, y se cambiaron las alícuotas con RPMI 1640 para el ensayo transwell. Las fracciones activas fueron agrupadas, cambiadas por tampón y concentradas en 50 µl con tampón I, y recargadas en la columna Mono s equilibrada con tampón I. La columna fue lavada con tres volúmenes de tampón I que contenían 0.3 M NaCl, y elusionada con 24 volúmenes de columna de gradiente lineal de NaCl de 0.3–0.4 m., Se recolectaron fracciones de 1 ml cada una, y se cambiaron las alícuotas con RPMI 1640 para el ensayo transwell final a fin de identificar la fracción que contenía la actividad quimioatrayente más fuerte.
análisis de espectrometría de masas
Las fracciones de la última etapa de purificación se concentraron en 50 µl y se analizaron en geles NuPAGE al 12% (Invitrogen). Los geles fueron teñidos con la tinción de plata Pierce para espectrometría de masas (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante., Las bandas de intensidades aumentadas en la fracción que contenía la actividad quimioatractante más fuerte se extirparon y se sometieron a digestión en gel antes de ser analizadas con un espectrómetro de masas Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). Los datos de espectrometría de masas se analizaron utilizando la base de datos Swissprot con el motor de búsqueda MASCOT.
His-tagged recombinant ccl21 and binding assay
la secuencia de codificación de ccl21 de ratón fue amplificada a partir de C57BL / 6 mouse spleen cDNA y clonada entre los sitios NdeI y XhoI del vector de expresión pET22b+ (Novagen), que proporciona una etiqueta His C-terminal., La proteína recombinante fue expresada en ratones BL21(DE3) y purificada por su etiqueta His. La pureza y la concentración de proteínas se evaluaron mediante el ensayo SDS-PAGE y BCA, respectivamente, y la bioactividad se verificó mediante un ensayo de movilización de calcio. Las proteínas recombinantes se conservaron a -80 °C hasta su utilización. Para medir la Unión de Ccl21-His a GPR174, con CCR7 como control positivo, se transfectaron 293 células T con constructos de fusión GPR174–GFP o CCR7–GFP., Las alícuotas de células transfectadas fueron incubadas con proteína Ccl21-His a concentraciones indicadas a 37 °C durante 30 min, lavadas dos veces con PBS frío y fijadas inmediatamente con paraformaldehído al 4%. Después de lavados en PBS, las células fijas fueron teñidas con un anticuerpo anti-His conjugado con ficoeritrina (clon J095G46, Biolegend) y analizadas por citometría de flujo., Las células GFP en cada muestra sirvieron como un control interno de tinción de fondo inespecífico, y la intensidad de fluorescencia Media (IMF) de las células GFP+ teñidas con anticuerpo anti-His conjugado con ficoeritrina, con la IMF de las células GFP correspondientes restada, se utilizó para cuantificar la unión específica a CCL21.
la medición de los flujos de calcio desencadenados por quimioquinas
Mouse Gpr174 y Ccr7 fueron amplificados por PCR y clonados en el plásmido pRK5. Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con plásmido de expresión GPR174, expresión CCR7 o control., Las células se separaron físicamente del vaso de cultivo 48 h después de la transfección, se lavaron dos veces con PBS y se teñieron con 1 µM de Indo-1 (Invitrogen) en PBS a 37 °C durante 30 min. Después de ser lavadas dos veces con PBS, las células se resuspendieron con la solución salina equilibrada de Hanks (Invitrogen) que contenía Hepes de 25 mM y FBS al 1%, y se mantuvieron en hielo. Cuando se sometió a la estimulación con quimiocinas, las células se introdujeron primero en un lote de agua a 37 °C durante 5 minutos de incubación, y luego se evaluaron en un citómetro LSR II (BD Biosciences) para establecer la línea de base para el estado no estimulado., Las células fueron estimuladas con una serie de concentraciones de ccl21 recombinante de 0,1 ng ml-1 a 10 µg ml−1. Las células en cada condición fueron monitoreadas y registradas continuamente durante 2 min. Al final, la ionomicina (Sigma) fue añadida a la muestra a una concentración final de 1 µg ml−1, y la muestra fue monitoreada y registrada durante 1 min. Las relaciones Indo-1(Unido)/indo-1(libre) se utilizaron para indicar las concentraciones intracelulares de Ca2+, como se analizó en FlowJo (TreeStar). La mayor concentración de Ca2+ estimulada por ionomicina fue utilizada al 100% para normalizar la respuesta de calcio inducida por CCL21., La CE50 se estimó en GraphPad ajustando una curva dosis-respuesta no lineal de tres parámetros.
inmunoprecipitación y western blotting
células B de ratón recién aisladas de ratones transgénicos GPR174–GFP BAC se activaron con 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat Anti-mouse IgM y 10 µg ml−1 anti-CD40 durante 48 h. estas células B activadas se suspendieron a 2 × 107 células por mililitro en medio RPMI que contenía 1% de FBS, y se dejaron sin tratar o estimuladas con 300 ng ml−1 ccl21 a 37 °C durante 30 min. Las células B se lisaron inmediatamente en un tampón de lisis np-40 al 1% (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% inhibidores de glicerol y proteasa). Para la inmunoprecipitación de GFP-marcado GPR174, lisados de 108 células B fueron incubados durante la noche con 20 µl de GFP-Trap beads (ChromoTek). Después de lavados repetidos, los inmunoprecipitados se elutaron por incubación en tampón de glicina de 0,2 M (pH 3,0) durante 10 min a temperatura ambiente, y luego se neutralizaron con 1 M Tris-HCl (pH 8,5). Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y transferidas a la membrana de polivinilideno (Miliporo). Las membranas fueron bloqueadas con solución salina tamponada Tris conteniendo 5% de ASC y 0,1% de Tween 20., Para detectar moléculas Diana por inmunoblotting, utilizamos anticuerpos anti-GFP de conejo (Abcam), anti-Gai-1 de conejo (Abcam), anti-Gai-2 de conejo (Abcam) y anti-Ga13 de conejo (Abcam). El anticuerpo conjugado HRP contra el conejo de la cabra fue comprado de Bioeasytech. Se detectaron inmunoblots mediante quimioluminiscencia mejorada (Thermo Fisher Scientific) y se analizaron las imágenes con el software ImageJ.
las células PCR cuantitativas
de los tipos deseados se clasificaron con un FACSAria III y se sometieron a extracción total de ARN con el Rneasy Plus Mini o Micro kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante., El ARN se transcribió a la inversa con MasterMix RT todo en uno (Abm). La PCR cuantitativa se realizó con qPCR MasterMix (Abm) en un sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., La expresión relativa de los genes diana entre diferentes muestras se comparó después de la normalización con la expresión de los genes de limpieza Actb o Gapdh.
el análisis estadístico de los datos
la Estadística y la gráfica se llevaron a cabo en Prism (Graphpad). A menos que se indique lo contrario, se utilizaron las pruebas t de Student no pareadas de dos colas para comparar las medias de los diferentes grupos.
resumen de informes
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el resumen de informes de Investigación de Nature vinculado a este artículo.