¿Qué es la secuenciación de Sanger?
la secuenciación de Sanger, también conocida como el «método de terminación de cadena», fue desarrollada por el bioquímico Inglés Frederick Sanger y sus colegas en 1977. Este método está diseñado para determinar la secuencia de bases de nucleótidos en una pieza de ADN (comúnmente menos de 1,000 bp de longitud). Secuenciación Sanger con 99.,La precisión de base del 99% se considera el «estándar de oro» para validar las secuencias de ADN, incluidas las ya secuenciadas a través de la secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de Sanger se utilizó en el proyecto del Genoma Humano para determinar las secuencias de fragmentos relativamente pequeños de ADN humano (900 bp o menos). Estos fragmentos fueron usados para ensamblar fragmentos de ADN más grandes y, eventualmente, cromosomas enteros.
secuenciación Sanger VS NGS
el desarrollo de tecnologías NGS ha acelerado la investigación genómica. El NGS puede secuenciar simultáneamente más de 100 genes y genomas enteros con ADN de baja entrada., La secuenciación de Sanger sigue siendo ampliamente utilizada en el campo de la secuenciación, ya que ofrece varias ventajas prominentes: (I) rentabilidad para secuenciar genes individuales y (II) precisión del 99,99%, especialmente adecuada para la secuenciación de verificación para mutagénesis dirigida al sitio o insertos clonados.
¿Cómo funciona la secuenciación de Sanger?
en la secuenciación de Sanger, una imprimación de ADN complementaria a la plantilla de ADN (el ADN a secuenciar) se utiliza para ser un punto de partida para la síntesis de ADN., En presencia de los cuatro trifosfatos de desoxinucleótido (dNTPs: a, G, C y T), la polimerasa extiende la imprimación agregando el dNTP complementario a la cadena de ADN plantilla. Para determinar qué nucleótido se incorpora a la cadena de nucleótidos, se utilizan cuatro trifosfatos de dideoxinucleótido (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP) Etiquetados con un tinte fluorescente distinto para terminar la reacción de síntesis. En comparación con dNTPs, ddNTPs tiene un átomo de oxígeno eliminado del ribonucleótido, por lo tanto no puede formar un enlace con el siguiente nucleótido., Después de la síntesis, los productos de reacción se cargan en cuatro carriles de un solo gel dependiendo de los diversos nucleótidos de terminación de cadena y se someten a electroforesis en gel. De acuerdo con sus tamaños, la secuencia del ADN se determina así.
Figura 1. La estructura de ddNTP y dNTP.crédito de la imagen: «whole-genome sequencing: Figure 1,» por OpenStax College, Biology).,
pasos de secuenciación de Sanger
El método de secuenciación de Sanger consta de 6 pasos:
(1) el ADN bicatenario (dsDNA) se desnaturaliza en dos ADN monocatenario (ssDNA).
(2) se adjunta una cartilla que corresponde a un extremo de la secuencia.
(3) se añaden cuatro soluciones de polimerasa con cuatro tipos de dNTPs pero solo un tipo de ddNTP.
(4) la reacción de síntesis de ADN se inicia y la cadena se extiende hasta que se incorpora aleatoriamente un nucleótido de terminación.
(5) los fragmentos de ADN resultantes son desnaturalizados en ssDNA.,
(6) los fragmentos desnaturalizados se separan mediante electroforesis en gel y se determina la secuencia.
Figura 2. El método de secuenciación Sanger en 6 pasos (adaptado de Gauthier 2008).