recientemente usamos CRISPR para interrumpir el oncogén Kras en dos líneas celulares independientes de adenocarcinoma de pulmón , que se derivaron de ratones Kras g12d; p53 fl/fl (KP). Aislamos dos clones unicelulares cada uno con deleciones de cambio de Marco en el exón 2 (Fig., 1A and Additional file 1: Figure S1a): KP1 carries a 2-NT «-CG» deletion in the g12d Alele and a 1-nt «-C» deletion in the otherwise wild-type (WT) Kras Alele; and KP2 carries a 2-nt «-GG» deletion. Ninguno de los clones produce proteína Kras de longitud completa, lo que indica que las tres eliminaciones interrumpen el marco de lectura de Kras.
sgrna targeting Kras induce el salto de exones en clones de una sola célula. a Schematic of an sgRNA targeting exon 2 of the mouse Kras gene (sgKras)., La punta de flecha roja denota el sitio de escisión Cas9. Las líneas celulares KP1 y KP2 fueron transducidas con lentivirus que codifica Cas9 y sgKras. Dos clones de una sola celda (clon KP1 y clon KP2) albergan eliminaciones de cambio de Marco. Las flechas negras indican las posiciones de los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). El codón G12D está subrayado. B Kras normalizado leer recuentos de RNA-secuenciación (RNA-seq) análisis de células parentales KP (azul) y clones KP (rojo). El RNA-seq se realizó dos veces para el clon KP2 y tres veces para los otros grupos. «+»denota alelo WT., C ARN-seq mostrando un salto parcial del exón 2 en clones KP1. Los números RNA-seq indican lecturas que abarcan las uniones de exones indicadas. Se muestran dos réplicas biológicas representativas. D el análisis RT-PCR del ARNm de Kras detecta una banda omitida del exón 2. Los tamaños de banda esperados son 331 PB y 209 PB. M, marcador molecular. «*»denotes indels in PCR products from clones. e gráfico de dispersión que muestra 22 eventos de exón que cambian en ambos clones KP1 y KP2. La exclusión del exón 2 de Kras es el evento más frecuente., Ψ, Índice de empalme porcentual
se sabe que las mutaciones de cambio de Marco en los exones tempranos desencadenan la desintegración mediada por tonterías (NMD) , que elimina los ARNm con codones de terminación prematura. Sin embargo, cuando analizamos los datos de secuenciación de ARNm (ARN-seq), encontramos que los niveles aparentes de ARNm de Kras (es decir, lecturas de ARNm normalizadas totales) solo se redujeron en un 19% en las células KP1 y en un 47% en las células KP2, en comparación con las células KP parentales (Fig. 1b). Ambos clones produjeron menos lecturas de exón 2, pero niveles normales de lecturas de exón 1 y 3 (Fig., 1c), sugiriendo que el exón 2 podría ser omitido en los clones KP1 y KP2. De hecho, detectamos lecturas de unión del exón 1-3, lo que indica que se omitió el exón 2 (Fig. 1C y archivo adicional 1: Figura S1b). Calculando la relación entre las lecturas del exón 2 y las lecturas totales, encontramos que el exón 2 está incluido en solo 64.0 ± 9.1% de las lecturas de Kras del clon KP1 (Fig. 1c y Cuadro 1). Se observó un salto Similar del exón 2 en clones KP2 (archivo adicional 1: Figura S1c)., De manera concordante, la transcripción inversa del ARNm de Kras seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) produjo dos productos: uno correspondía al ADN complementario de KRAS intacto (ADNc) y el otro correspondía a la isoforma del exón 1-3 (Fig. 1d). La isoforma del exón 1-3 retiene un marco parcial de lectura abierta de Kras que podría iniciar la traducción de un codón ATG en el exón 3 (archivo adicional 1: Figura S2) y producir una proteína Kras severamente truncada.,
La edición de Kras no indujo un empalme alternativo en todo el genoma. Identificamos 97 exones empalmados alternativamente en células KP1 y 177 eventos en células KP2. Los clones KP1 y KP2 compartieron 22 eventos de inclusión o exclusión de casetes, siendo la exclusión del exón 2 de Kras el mayor cambio en ambos clones (Fig. 1e y expediente adicional 1: Cuadro S3). Por lo tanto, la edición del exón 2 de Kras indujo específicamente el salto del exón 2 de Kras., Notablemente, mientras que las transcripciones de KRAS g12d de ratón (GGU a GAU) no omiten el exón 2 en las células KP parentales, encontramos que ~15% de las transcripciones de KRAS g12s humanas (codón 12 GGU a AGU) omiten el exón 2 en la línea celular de cáncer de pulmón humano A549 (archivo adicional 1: Figura S1d). No pudimos predecir la ganancia o pérdida de potenciadores o silenciadores de empalme de exones , pero nuestros datos sugieren que las secuencias cerca del codón 12 de Kras promueven la inclusión del exón 2 en Kras humanos y de ratón. El salto de exones inducido por la edición de CRISPR no se limitó a Kras o a células KP del ratón., Un estudio reciente mostró que la edición CRISPR del exón FLOT1 3 en células HeLa puede causar el salto del exón 3, exón 4, o exones 3, 4, y 5 . También detectamos saltos de exón poco frecuentes cuando nos dirigimos al exón 11 del LMNA en células HCT116 humanas (archivo adicional 1: Figura S3). Omitir el exón 11 del LMNA produce una transcripción en el marco que podría traducirse en una proteína neomórfica.
para explorar más a fondo la idea de que el salto del exón podría producir una transcripción funcional en el marco, preguntamos si la edición mediada por CRISPR del exón 3 de Ctnnb1 podría inducir el salto del exón y causar un fenotipo de ganancia de función., El exón 3 de Ctnnb1 codifica residuos de fosfoaceptores que promueven la degradación del factor de transcripción de β-catenina ; la escisión genética del exón 3 de Ctnnb1—que está en el marco del exón 4—estabiliza Una β-catenina constitutivamente activa que se acumula en el núcleo . Diseñamos 11 sgRNAs que se dirigen a regiones a lo largo del exón 3 de Ctnnb1 (ctnnb1-sg1 a-sg11), transduced sgrnas individuales en células KP, y utilizamos secuenciación de alto rendimiento para analizar el alcance de la edición en el sitio de destino de sgRNA en cada línea (Fig. Eje x 2b, archivo adicional 1: Figura S4 y archivo adicional 2: Tabla S4)., Tres sgRNAs (CE6, CE9 y CE10) se dirigieron ineficientemente a la Ctnnb1. Ocho de los sgRNAs Ctnnb1 (CE1 a CE5, CE7, CE8 y CE11), sin embargo, Indel inducidos en sus sitios de destino con frecuencias que superaron el 20%. Por ejemplo, Ctnnb1-sg1 generó inserciones + T en aproximadamente el 65% de las lecturas (Fig. 2c). En cada población objetivo por un sgRNA ctnnb1 fuerte, detectamos tres productos RT-PCR que abarcan los exones 2 a 5 (Fig. 2d). El producto principal corresponde a la transcripción normalmente empalmada que incluye el exón 3. Los otros dos productos corresponden a transcripciones alternativamente empalmadas: una que omite el exón 3 (i. e., empalme exón 2-4, Fig. 2e) y uno que omite los exones 3 y 4 (es decir, el empalme del exón 2-5, Fig. 2f). El sgRNAs ctnnb1 dirigido a cualquiera de las cadenas de ADN indujo el salto del exón y la actividad de la nucleasa Cas9 fue esencial para el salto del exón (Fig. 3a).
ctnnb1 sgrnas targeting exon 3 induces exon skipping. un esquema del gen Ctnnb1. El exón 3 en el marco codifica un dominio inhibitorio: los aminoácidos de fosforilación 33, 37, 41 y 45 promueven la degradación de la proteína β-catenina., La pérdida del exón 3 estabiliza la β-catenina. Once sgRNAs fueron diseñados para atacar el exón 3: sgrnas fuertes en rojo y sgrnas débiles en negro, respectivamente. los sgRNAs que usan PAM » NGG «se muestran por encima del exón 3 y los que usan PAM» CCN » se muestran por debajo del exón 3. B correlación entre la omisión del exón 3 y la eficiencia del sgRNA. Los Indel genómicos se midieron mediante secuenciación profunda. Las células KP estaban infectadas con lentivirus. Las eficiencias de omisión del exón 3 son de (d). No se determinaron los Indel de la CE11. los sgRNAs que inducen > 20% indels están marcados en rojo., la distribución C de los Indel sg1 muestra que la inserción T (+T) en el nucleótido 97 del sitio de escisión Cas9 del exón 3 (punta de flecha roja) fue la más frecuente. La secuencia PAM está en azul. d RT-PCR usando cebadores que abarcan los exones 2 y 5 muestra un salto parcial del exón. M marcador molecular. sgGFP es un control sgRNA. Las bandas de salto del exón 3 se cuantificaron utilizando el software ImageQuant TL y se normalizaron a bandas cDNA de larga duración. la CE4 mostró bandas débiles visibles que no pudieron cuantificarse., e, F la clonación de TOPO y la secuenciación de Sanger confirmaron que las dos bandas más bajas de RT-PCR en (c) son empalmes alternativos del exón 2-4 y del exón 2-5, respectivamente. G Western blot análisis de β-catenina. La β-catenina de longitud completa es ~86 kD. β-catenina sin exón 3 (exón delta 3) es ~77 kDa. La actina sirve como un control de carga de la
Cas9 actividad de nucleasa necesarios para la omisión de uno o más exones., a RT-PCR analysis of ctnnb1 mRNA in KP cells transduced with lentivirus that encode sgCtnnb1.2 and nuclease-defective Cas9 (dCas9), dCas9-KRAB fusion, or WT Cas9. La RT-PCR se realizó utilizando cebadores en exones 2 y 7 en poblaciones de células KP transducidas después de la selección de puromicina y la clasificación de FACS. Se muestran la longitud del exón y la fase del marco de lectura. Solo el producto de empalme exon 2-4 retiene una secuencia de codificación de β-catenina en el marco. B análisis RT-PCR del ARNm Ctnnb1 en células KP transducidas con lentivirus que codifican Cas9 y sgGFP, sg3 o sg5., «- «, no tratada
Western blot analysis revealed that cell populations transduced with the strong sgrnas produce a smaller ~74 kD β-Catenin protein that corresponds in size to that expected from the exon 2-4 splice product (Fig. 2g). La proteína β-catenina de longitud completa no se agotó significativamente cuatro días después de la transducción. Para probar si el empalme alternativo depende de la expresión continua de Cas9 o sgRNA en los vectores lentivirales, co-transfectamos Cas9 y ctnnb1-sg1 o un control sgRNA no dirigido., Siete días después de la transfección, cuando la Cas9 transfectada y los ARN guía deben agotarse, examinamos la localización de β-catenina por inmunofluorescencia. En células de fibroblastos de ratón transfectadas con un sgRNA de control no dirigido, β-catenina localizada en las uniones celulares (archivo adicional 1: Figura S5a). Por el contrario, en muchas células transfectadas con ctnnb1-sg1, detectamos β-catenina en el núcleo (archivo adicional 1: Figura S5a)., Estos resultados sugieren que la edición continua no es necesaria para el salto del exón y que el salto del exón 3 inducido por la edición mediada por CRISPR del exón 3 de Ctnnb1 produce una isoforma de β-catenina de ganancia de función.
analizamos además Transcripciones que abarcan exones 2 a 7 en poblaciones celulares tratadas con ctnnb1-sg2, -sg3 y-sg5. Además de la isoforma de longitud completa, detectamos cuatro transcripciones con el exón 2 aparentemente empalmado a cada exón aguas abajo (es decir, exón 2-4, exón 2-5, exón 2-6 y exón 2-7; Fig. 3a, b)., No entendemos el mecanismo de este salto de exón aparentemente promiscuo inducido por la edición del exón 3 de Ctnnb1, ni hemos sido capaces de correlacionar el salto de exón promiscuo con sitios diana específicos o mutaciones indel en el exón 3. Sin embargo, aislamos un clon editado por ctnnb1-sg3 que sugiere un mecanismo potencial (archivo adicional 1: Figura S6a). Este clon bialélico contiene una eliminación de 3-bp en un alelo y una gran eliminación de 832-bp en el otro; la eliminación de 832-bp fusiona el extremo 5′ del intrón 2 al extremo 3′ del exón 4 (Archivo adicional 1: Figura S6)., Detectamos dos transcripciones en estas células: la transcripción correctamente empalmada que incluye la deleción de 3-bp y una transcripción que incluye intrón 2 fusionado al exón 4 (Archivo adicional 1: Figura S6c y tabla 1). Estos resultados sugieren que el aparente salto de exones detectado en poblaciones de células editadas podría reflejar reordenamientos del genoma que eliminan exones.
dos experimentos apoyan la idea de que un solo sgRNA puede inducir grandes deleciones genómicas que eliminan exones., Por ejemplo, aislamos 15 clones de células 3T3 de ratón transfectadas transitoriamente con Cas9 y ctnnb1-sg1, y encontramos que cuatro clones (es decir, clones 4, 5, 13 y 15) mostraron un aparente salto de exones por RT-PCR. La PCR genómica reveló reordenamientos del genoma en tres de estos clones: deleciones grandes (> 500 PB) y deleciones más pequeñas (~100 PB) en los clones 4 y 15, e inserciones grandes en los clones 13 y 15 (archivo adicional 1: Figura S7)., Además, después de apuntar al exón 6 de p65 / RelA, aislamos un clon bialélico de p65 (#15): un alelo alberga una inserción 1-nt «+A» y el otro alberga una eliminación de 2268-bp que elimina los exones 5, 6 y 7 (archivo adicional 1: Figura S8a, c–e). En el clon #15 de p65, detectamos la transcripción completamente empalmada y un producto de empalme exón 4-8 (archivo adicional 1: Figura S8c). Ambos alelos codifican transcripciones frameshifted y ambas transcripciones p65 están presentes en niveles más bajos que WT (archivo adicional 1: Figura S8b)., También aislamos un clon P65 editado (#31) homocigoto para la misma inserción + A que en el clon #15, pero el clon #31 no produce alternativamente transcripciones empalmadas. Por lo tanto, la transcripción empalmada del exón 4-8 en el clon #15 resulta de la eliminación de los exones 5, 6 y 7. Estos grandes eventos de deleción de exones fueron inesperados y se perderían usando los típicos ensayos de cribado basados en PCR.,
la capacidad de causar una actividad de ganancia de función induciendo el salto del exón o la escisión del exón sugirió que la edición meditada en CRISPR usando un solo sgRNA podría ser una forma útil de rescatar parcialmente la función de un gen de la enfermedad que requiere un rescate de bajo nivel. La reparación del ADN homólogo mediada por CRISPR se ha utilizado para corregir mutaciones prematuras del codón de parada en el gen Dmd en un modelo de ratón de DMD y varios grupos han utilizado CRISPR para eliminar exones de Dmd y restaurar parcialmente la expresión de Dmd . Diseñamos cuatro lentivirus Sgrna / Cas9 que se dirigen a diferentes sitios en el exón 23 del gen Dmd (Fig., 4a, b) y mioblastos de ratón c2c12 transducidos, una línea celular ampliamente utilizada como modelo para la distrofia muscular de Duchenne (DMD). En células c2c12 transducidas con Dmd sgRNAs, detectamos un producto RT-PCR que corresponde al producto de empalme normal que contiene exón 23. La secuenciación de estos productos de RT-PCR reveló que solo Dmd-sg2 editó eficientemente el exón 23 de Dmd, como lo demuestran los Picos de secuencia mixtos más allá del Sitio objetivo de sgRNA (archivo adicional 1: Figura S9). En células transducidas con Dmd-sg2, también detectamos un producto RT-PCR correspondiente al exón 22 empalmado al exón 24 (Fig. 4c, d)., Por lo tanto, apuntar al exón 23 con un sgRNA podría ser suficiente para inducir el salto parcial del exón y producir un marco de lectura Abierto de distrofina intacto. Duchenne es un ejemplo clásico de una enfermedad en la que una pequeña cantidad de restauración funcional puede proporcionar un beneficio clínico sustancial .
Un exón 23 de Dmd dirigido a sgRNA puede restaurar parcialmente el mRNA de distrofina en el marco. a Schematic of sgRNA targeting and skipping of mouse Dmd exon 23 and location of primers for RT-PCR analysis., Omitir el exón 23 generará ARNm en el marco. B sgrna target sites in Dmd exon 23. C análisis RT-PCR de células mioblásticas de ratón c2c12 transducidas con lentivirus que codifican Cas9 y sgDmd1, 2, 3 o 4. Los tamaños de banda esperados son 353 PB y 140 PB. M marcador molecular. D el análisis de secuencia de la banda de ADNc de 140 bp de células tratadas con sgDmd2 confirmó el empalme del exón 22 al exón 24