Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174-puutteellisia hiiriä syntyy vakio-geeni kohdistaminen menettelyjä korvata Gpr174 avoin lukeminen runko Bensley/neo kasetti käyttämällä 129SvEvBrd alkion kantasolujen linja (Texas A&M-Instituutin Genomien Medicine, TG0128). Nämä GPR174: n puutteessa olleet hiiret siirrettiin c57bl/6-hiiriin 12 sukupolven ajan. Asiaa hiirillä on C57BL/6 tausta oli interbred saada GFP-ilmaista MD4 hiiret ja dsRed-ilmaista GPR174-riittävä tai puutteellinen MD4 hiiriä., Kokeissa käytettiin 6-12 viikon ikäisiä poikueita ja osoitettuja sukupuolia. Hiirikokeiden otoskoot määritettiin empiirisesti, ja hiiret satunnaistettiin kontrolloimaan tai kokeelliseen ryhmään. Tässä esitetyissä hiirikokeissa ei tarvinnut sokaista. Kaikki hiiret olivat ylläpidetään erityisissä-taudinaiheuttaja-vapaa ehdot ja käytettiin mukaisesti valtion ja Tsinghuan Institutional Animal Care and Use Committee suuntaviivat eläinten hyvinvointia.,
GPR174–GFP BAC siirtogeenisiä hiiriä
– Sekvenssien koodaus glysiini–glysiini–glysiini–seriini (GGGS) linker (toistuu neljä kertaa) ja parannettu GFP (EGFP) oli sijoitettu välittömästi ennen lopetuskodonin GPR174 open reading frame hiiren BAC klooni RP23-206J14, jonka homologinen rekombinaatio. Muunneltu BAC puhdistettiin ja mikroinjektoitiin hedelmöittyneen munasolun pronukleiin transgeenisten reportterien tuottamiseksi. Perustajahiirtä, joka seulottiin positiiviseksi GFP: tä ilmentäville veren B–soluille, käytettiin edelleen lisääntymään B6-hiirillä gpr174-GFP BAC-kannan määrittämiseksi.,
Cell culture, retrovirus-ja in vitro-transduktio
Naiiveja T-soluja tai B-solut eristettiin käyttäen Negatiivinen CD4 T-solujen Eristäminen Kit tai Naiivia B-solua Isolation Kit (Miltenyi Biotec) mukaan valmistajan protokollia. Jotta tästä seuraa käytännössä kaikissa tapauksissa kohde-geenien B-soluja, puhdistettua B-solut, jotka on aktivoitu 1 µg ml−1 lipopolysakkaridi (Sigma) 1 päivä ennen spin-tartunnan retroviral supernatantit 1500 g 2 h, kuten described18.
luuytimen chimaerojen rakenne
B6 vastaanottajahiiret säteilytettiin kuolettavasti Röntgenillä (5.,5 Gy kahdesti) ja sitten annetaan laskimoon siirto 3 × 106 sukupuoli-hyväksytty luun-luuytimen soluja, joka koostuu 80% µMT soluja ja 20% GPR174-riittävä tai puutteellinen soluja. Chimaeroja käytettiin kokeissa kuudesta kahdeksaan viikkoa käyttökuntoon saattamisen jälkeen.
Gonadectomy
Hiiret vieroituksen jälkeen olivat puutuneet kanssa avertin (2.5%, 0.015 ml g−1 painokiloa) injektiona vatsaonteloon. Naarashiirten munasarjapoistoa varten molemmilta puolilta paljastettiin munasarjat, jotka poistettiin molemminpuolisten selkävikojen kautta., Sillä orchidectomy uroshiirillä, mediaani vatsan viilto oli tehty paljastaa ja poistaa kivekset molemmin puolin. Sham-käyttää valvonta-hiirille tehtiin leikkaus, mukaan lukien kahdenväliset selkä viillot tai mediaani vatsan viilto ilman poistaminen munasarjat tai kivekset. Leikkaushaavan aukot ommeltiin, ja antibiootteja ja kipulääkkeitä levitettiin paikallisesti. Hiiret saivat toipua kahdeksan viikkoa ennen seuraavia kokeita.,
Testosteroni hoito
Kuusi – kahdeksan viikkoa vanhoja hiiriä ihon alle pistetään testosteroni (10 mg kg−1 ruumiinpainoa) liuotetaan auringonkukkaöljy joka toinen päivä kahden viikon ajan. Autokontrollihiiriä hoidettiin pelkällä auringonkukkaöljyllä.
Adoptiovanhemmat siirto, rokotukset ja virusinfektio
mitata germinal-keskuksen muodostumista MD4 B-solujen, 105 OT-II T-solut ja 5 × 105 MD4 B-solut merkitty genotyypit olivat laskimoon siirretään uros B6 vastaanottajat, jotka sittemmin immunisoitu ihon alle 0.,5 µg lipopolysakkaridia ja 30 µg HEL–OVA-konjugaatin antigeenia alumissa (Thermo Scientific). HEL-OVA tehtiin kemiallisella risteytyksellä HydraLink-konjugaatiosarjan (SoluLink) kanssa, kuten aiemmin kuvailtiin19. Mitata germinal-keskuksen muodostumista vastaus SRBC rokotukset tai lymfosyyttinen koriomeningiittivirus (LCMV) infektio, hiiret olivat injektoitiin intraperitoneaalisesti 5 × 108 SRBCs (alkaen Z. Baiji) tai 2 × 105 plakkia muodostavat yksiköt LCMV Armstrong virus (L. Ye ja R. Ahmed).,
EAE, jonka FACEBOOK proteiinia rokotukset
– sekvenssi koodaa ensimmäinen 120 aminohappoja ihmisen TWITTER monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ihmisen aivot täydentävät DNA-kirjasto, ja kloonattu välillä Ndel-ja XhoI-sivustoja pET22b+ ilme vektori (Novagen). Ihmisen FACEBOOK-proteiinia oli ilmaistu BL21(DE3) Escherichia coli ja puhdistetaan sen karboksi-terminaali histidiini (His tag). Proteiinin puhtautta arvioitiin SDS-Pagen ja bicinchoninic acid (BCA) – proteiinimäärityksellä. Rekombinantit proteiinit säilyivät -80 °C: ssa käyttöön asti., Aiheuttaa EAE -, luun-luuytimen-kimeerinen eläimiä ilmoitettu tyypit immunisoitiin ihon alle kylki 200 µg rekombinanttia ihmisen TWITTER proteiinia emulgoitu täydellinen Freund adjuvantti on päivä 0. Hiirille annettiin 200 ng pertussis-toksiinia (Invitrogen) laskimoon päivinä 0 ja 2. Hiiriä seurattiin päivittäin sokeasti taudin etenemisen varalta 1.päivästä alkaen. Taudin vaikeusaste oli seuraava: 0, ei kliinisiä oireita; 1, halvaantunut häntä; 2, koordinoidun liikkeen menetys ja takaraajojen pareesi; 2,5, yhden takaraajan halvaus; 3, halvaus molempien takaraajojen; 3.,5, halvaus molemmat takajalat ja heikkous forelimbs; 4, halvaus forelimbs; ja 5, kuolemaisillaan. Taudin vaikeusasteen vertailemiseksi tutkimme kymmenen hiirtä per tila per koe, ja analysoimme taudin pisteet ajan mittaan kaksisuuntaisella ANOVALLA.
virtaussytometria
Mittaus-antigeeni-spesifisten vasta-aineiden titteri
mitata SRBC-spesifisiä vasta-ainetitteri, me lyysattiin 5 × 108 SRBCs 1 ml kahdesti tislattua vettä ja ne sentrifugoidaan 15 000 t.p.m. 20 min., Pelletti oli sekoitettava uudelleen PBS: llä ja käyttää takki MaxiSorp entsyymi-immunologinen määritys (ELISA), levyt (Nunc Maxisorp) yön yli 4 °C. mitata TWITTER-erityisiä seerumin vasta-aineita, käytimme 2 µg ml−1 puhdistettua rekombinantti ihmisen TWITTER takki ELISA-levyt. Epäspesifinen sitoutuminen oli tukossa ja 1% naudan seerumin albumiini (BSA) vuonna PBS-Tween-20: tä (pbst: llä) 2 h 37 °C, jonka jälkeen inkubaation 2× sarja laimennoksia seeruminäytteistä hiiret immunisoitiin 1 h 37 °C: ssa., Levyt pestiin ja inkuboitiin, jossa piparjuuren peroksidaasi (HRP)-konjugoitua anti-hiiri IgG vasta toissijainen (1/20,000) 1 h 37 °C. Levyt pestiin, kehitetty 3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiini (TMB) ja pysäytetään 1 M HCl. Asetimme tyhjät kaivot nollaksi ja kirjasimme absorbanssin 450 nm: iin. Negatiivisena kontrollina käytettiin hiiristä saatuja seerumeita; valoraja-arvo oli negatiivisen kontrollin optinen tiheys 450 nm: ssä (OD450) kerrottuna 2,1: llä. Hyvänä pidettiin kaivoa, jonka OD450-arvo oli vähintään raja-arvo., Positiivisuutta antaneen näytteen suurin laimennos on näytteen titteri.
Jakelu B-solujen immunohistokemia
erilaisia kokeiluja, naiivi, B-solujen, B-solujen käytössä 1 h 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat anti-mouse-IgM (Jackson Immunoresearch), tai B-solujen transduced kanssa retrovirus siirrettiin B6 vastaanottajille. Kun tarvitaan, nämä solut on merkitty 1 µM tetramethylrhodamine (JACK), 4-kloorimetyyli-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin (CMF2HC) tai 5-chloromethylfluorescein diasetaatti (CMFDA) (Invitrogen)., Perna tai imusolmukkeet imusolmukkeet vastaanottajan hiiret olivat kiinteä 1% paraformaldehydi 12 h ja sitten kuivattu 30% sakkaroosia liuosta varten, 12 h 4 °C. varmistaa maksimaalisen edustus eri elinten alueiden lopullinen aineisto, me käsitellään peräkkäin kudosleikkeiden ja värjätään ne tarkoitettu vasta-aineita. Värjäysreagenssien mukana eFluor450-Vakuutusryhmädirektiiviä (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), rabbit anti-GFP (abcam), ja AF488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen)., Diat olivat asennettu ProlongGold Antifade-reagenssia (Invitrogen) ja tutkittiin Olympus FV1000 pystymikroskooppi. Kuvat analysoitiin kanssa Imaris (Bitplane) ja ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
Pernan stroomaan valmistelu
Perna hiiret, rotat tai siat olivat toistuvasti painetaan maahan ja vastaan metalli mesh vapauttaa punainen verisolujen ja lymfosyytit. Loput unsuspendable, amorphic strooman kudosta elementtejä olivat perusteellisesti pestiin PBS: llä ennen kuin ne on sijoitettu B27 seerumin vapaa-kasvatusalustaa (Invitrogen) ja inkuboitiin 37 °C: ssa 12 h., Hiirillä kolmen eläimen stroomaalielementit viljeltiin 1 ml: n väliaineessa. Sioilla 1 pernan stroomaalielementit viljeltiin 80 ml: ssa. Tuloksena kulttuuri oli sentrifugoidaan 10 000 t.p.m. 60 min saada conditioned medium, joka oli joko välittömästi käyttää kokeita tai pakastettu -20 °C: ssa käyttöön asti.
Transwell-määritys
B-solut, jotka on aktivoitu 1 µg ml−1 lipopolysakkaridi 60 h käytettiin määritys eri jakeet, jotka johtuvat biokemialliset fraktiointi., Naiivia B-solua-tai B-solujen, jotka on aktivoitu 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat anti-mouse-IgM (Jackson Immunoresearch) ja 10 µg ml−1 anti-CD40 (klooni FGK4.5 -, Bio-X-Cell) käytettiin assay CCL21-aiheuttama muuttoliike. Kun B-solujen eri genotyyppejä verrattiin vähintään kolme luovuttajan hiiret kunkin genotyypin ja hoitoa käytettiin eristämään B-solut kunkin kokeilla, ja sisarukset olivat aina käyttää. B-solujen keskeytettiin klo 106 solua / ml ja lepäsi RPMI, joka sisälsi 1% FBS-37 °C 1 h., Seuraava yhteensä 100 µl solususpensiota lisättiin ylempi kamari 5-µm-pore Transwell (Corning Vastanäyttelijä), ja yhteensä 150 µl houkutin sisältäviä ratkaisuja on lisätty alaosaan. Nämä ratkaisut sisältyvät kulttuuri keskipitkällä ilmastointi, jossa raakaöljyn hiiren pernan stroomaan valmistelu -, kulttuuri-medium ilmastointi, jossa raaka sian pernan stroomaan valmistelu, eluointi jakeet alkaen kromatografia, kasvatusalustaa, joka sisältää yhdistelmä-CCL21 ja CCL19 (Peprotech), tai 18/0 LysoPS (Avanti Polar Lipidit) ilmoitti pitoisuudet., Joitakin kokeiluja, hiiren strooma-conditioned medium oli ensin täydennetty, että lopullinen pitoisuus on 5 µg ml−1 neutraloivia vasta-aineita vastaan hiiri CCL21 tai CCL19 (R&K-järjestelmä) tai vuohen IgG isotype-ohjaus, ja inkuboitiin 4 °C: ssa 3 h ennen käytetään transwell-testillä. Vasta-aine annos oli vähintään riittävä neutraloimaan 100 ng ml−1 CCL21 tai CCL19, sellaisena kuin se on määritelty alustavia kokeiluja. Solujen annettiin siirtyä 3 tunnin ajan inkubaattorissa 37 °C: ssa., Solut, jotka oli siirtynyt pohjaan kaivot olivat lueteltujen virtaussytometria, jossa loisteputki A20-solujen tiedetään numerot lisätään välittömästi ennen lukemista, koska sisäinen laskenta standardin. Jokainen tila mitattiin kolmikaivoissa, ellei toisin mainita.
Biokemiallisia fraktiointi
Kromatografia suoritettiin käyttäen ÄKTApurifer 10 fast proteiini nestekromatografia (FPLC) järjestelmä (GE Healthcare) 4 °C: ssa, lukuun ottamatta viimeinen vaihe, joka toteutettiin käyttäen ÄKTAmicro FPLC-järjestelmä (GE Healthcare)., Yhteensä 1200 ml sian strooma-conditioned medium oli soveltaa anion-exchange sarake (250 ml bed volume) tasapainotettu buffer I (25 mM Hepes, pH 7.0). Pylväs pestiin kolmella kolonnimäärällä, ennen kuin se eluoitiin kolmella pylväsmäärällä puskuria I täydennettynä 1 M NaCl: llä. Flow-kautta oli puskuri-muuttunut buffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8.5) 100 ml, ja niitä on anioni-ioninvaihtokolonni tasapainotettu buffer II. Kolonni pestiin kaksi sarake määriä buffer II ja eluoitiin, jossa on kaksi saraketta määriä 0,1–0,5 M lineaarinen NaCl-gradientti., Jakeet 10 ml kutakin kerättiin, ja näytettä oli puskuri-muuttunut RPMI 1640 varten transwell-testillä. Aktiivinen jakeet yhdistettiin ja buffer-muuttunut 10 ml buffer II ja lastataan hepariini sarakkeessa (5 ml bed volume) tasapainotettu buffer II. Kolonni pestiin 12 sarake määriä buffer II ja eluoitiin 4 sarake määriä 0-2 M lineaarinen NaCl-gradientti. Jakeet 2 ml kutakin kerättiin ja näytettä oli puskuri-muuttunut RPMI 1640 varten transwell-testillä. Aktiiviset jakeet yhdistettiin uudelleen, puskuri-vaihdettiin 0: ksi.,5 ml puskuria ja lastataan Superdex-75 sarake (24 ml bed volume) tasapainotettu buffer I sarakkeessa oli eluoidaan yhden sarakkeen määrä puskuri I. Jakeet 0,5 ml kukin on kerätty, ja näytettä oli puskuri-muuttunut RPMI 1640 varten transwell-testillä. Aktiivinen jakeet yhdistettiin ja tiivistettiin 0.5 ml ladata kiinni Mono-S sarake (1 ml bed volume) tasapainotettu buffer I-pylväs pestiin 12 sarake määriä buffer I ja eluoitiin 25 sarake määriä 0-0.5 M lineaarinen NaCl-gradientti., Jakeet 1 ml kutakin kerättiin, ja näytettä oli puskuri-muuttunut RPMI 1640 varten transwell-testillä. Aktiivinen jakeet yhdistettiin, puskuri-muuttunut ja keskittynyt 50 µl puskuria en, ja lastataan uudelleen Mono S sarake tasapainotettu buffer I-pylväs pestiin kolme sarake määriä buffer I, joka sisältää 0,3 M NaCl, ja eluoitiin 24 sarakkeen määrät 0,3–0,4 M lineaarinen NaCl-gradientti., Jakeet 1 ml kutakin kerättiin, ja näytettä oli puskuri-muuttunut RPMI 1640 lopullinen transwell-määritys tunnistaa jakeen, joka sisälsi vahvin chemoattractant toimintaa.
massaspektrometria analyysi
Jakeet viimeinen puhdistusvaihe oli keskittynyt 50 µl ja analysoidaan 12% NuPAGE geelit (Invitrogen). Geelit värjättiin kanssa Pierce hopea tahra massaspektrometria (Thermo Fisher Scientific) valmistajan mukaan on pöytäkirja., Bändit lisääntynyt intensiteetit murto sisältävät vahvin chemoattractant toimintaa leikattiin irti ja kohdistuu in-geeli ruoansulatusta, ennen kuin tutkittava Q Exactive HF-massaspektrometri (Thermo Fisher Scientific). Massaspektrometrian tiedot analysoitiin SWISSPROT-tietokannan avulla maskotin hakukoneella.
Hänen-koodattu yhdistelmä CCL21 ja sitova määritys
hiiri CCL21 koodaus järjestys oli monistettu C57BL/6 hiiren perna ekspressio ja kloonattu välillä Ndel-ja XhoI-sivustoja pET22b+ ilme vektori (Novagen), joka tarjoaa C-terminaali Hänen tag., Rekombinantti proteiini ilmaistiin BL21 (DE3) – hiirillä ja puhdistettiin sen tunnisteella. Proteiinin puhtautta ja pitoisuutta arvioitiin SDS–PAGE-ja BCA-määrityksellä, ja bioaktiivisuus varmistettiin kalsiumin mobilisointimäärityksellä. Rekombinantit proteiinit säilyivät -80 °C: ssa käyttöön asti. Mitata CCL21–Hänen sitoutuminen GPR174, jossa CCR7 kuin positiivinen kontrolli, 293T-solut olivat transfektoiduissa GPR174–GFP tai CCR7–GFP fusion konstruktioita., Näytettä transfektoiduissa soluissa oli sitten inkuboitiin kanssa CCL21–Hänen proteiinin pitoisuudet ilmoitettu 37 °C: ssa 30 min, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä, ja korjata välittömästi 4% paraformaldehydi. Kun pesut PBS, kiinteä solut värjätään phycoerythrin-konjugoitu anti-Hänen vasta-ainetta (klooni J095G46, Biolegend) ja analysoidaan virtaussytometria., GFP− solut kunkin näytteen toimi epäspesifinen tausta värjäys sisäisen valvonnan, ja fluoresenssi-intensiteetti (MFI) GFP+ solut värjätään phycoerythrin-konjugoitu anti-Hänen vasta-aine, RAHALAITOSTEN vastaavat GFP− soluja vähennetään, käytettiin määrällisesti erityisiä CCL21 sitova.
Mittaus kemokiinin-laukaisi kalsiumia vuot
Hiiri Gpr174 ja Ccr7 monistettiin PCR: llä ja kloonattu osaksi pRK5 plasmidi. HEK293T-solut olivat hetkellisesti transfektoiduissa GPR174-ilmaista, CCR7-ilmaista tai hallita plasmidi., Solut olivat fyysisesti irrallaan kulttuurin alus 48 tuntia transfektion jälkeen, pestiin kaksi kertaa PBS: llä, ja värjättiin 1 µM Indo-1 (Invitrogen) PBS 37 °C: ssa 30 min. Kun solut oli pesty kahdesti PBS: llä, ne sekoitettiin uudelleen Hanksin tasapainotetulla suolaliuoksella (Invitrogen), joka sisälsi 25 mm Hepoa ja 1% FBS: ää, ja pidettiin jäällä. Kun siihen kohdistuu kemokiinin stimulaatio, solut olivat ensin tuodaan vettä erä 37 °C: ssa 5 min inkubaation, ja sitten arvioida LSR II cytometer (BD Biosciences) perustaa lähtötilanteen stimuloimattomissa valtion., Soluja stimuloitiin, jonka pitoisuus sarja yhdistelmä CCL21 vaihtelevat 0,1 ng ml−1-10 µg ml−1. Soluja seurattiin kussakin tilassa jatkuvasti ja kirjattiin 2 minuutin ajan. Lopussa, ionomycin (Sigma) lisättiin vielä näytteen lopullinen pitoisuus on 1 µg ml−1, ja näyte on edelleen seurattava ja kirjattava 1 min. Indo-1(sidottu)/Indo-1(vapaa) tunnusluvut käytettiin osoittamaan solunsisäinen Ca2+ – pitoisuus, kun analysoidaan FlowJo (TreeStar). Korkein Ca2+ – pitoisuus kannustanut ionomycin käytettiin 100% normalisoida kalsium vastaus aiheuttama CCL21., EC50 arvioitiin Graphpadissa sovittamalla siihen kolmen parametrin epälineaarinen annos – vastekäyrä.
Immunoprecipitation ja western blotting
Juuri eristetty hiiri B-soluja GPR174–GFP BAC siirtogeenisiä hiiriä, jotka on aktivoitu 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat anti-mouse-IgM-ja 10 µg ml−1 anti-CD40 48 s. Nämä aktivoituneet B-solut olivat sitten keskeytettiin 2 × 107 solua / ml: vuonna RPMI, joka sisälsi 1% FBS, ja se jätetään hoitamatta tai stimuloidaan 300 ng ml−1 CCL21 37 °C: ssa 30 min. Tämän jälkeen B-solut lysoitiin välittömästi 1%: ssa NP-40-lysis-puskurista (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% nonidet P-40, 20% glyserolia ja proteaasinestäjiä). Sillä immunoprecipitation GFP-tagged GPR174, lysaatit 108 B-solut inkuboitiin yön yli 20 µl GFP–Ansa helmiä (ChromoTek). Toistuvasti pesuissa, immunoprecipitates olivat eluoitiin itämisaika 0,2 M Glycine buffer (pH 3.0) 10 min huoneenlämmössä, ja sitten neutraloidaan 1 M Tris-HCl (pH 8.5). Proteiinit erotettiin SDS-Pagella ja siirrettiin polyvinylideenikalvoon (Millipore). Kalvot tukkeutuivat Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisältää 5% BSA: ta ja 0,1% Tween 20: tä., Tunnistaa kohde-molekyylejä, joita immunoblotting, käytimme rabbit anti-GFP (Abcam), rabbit anti-Gai-1 (Abcam), rabbit anti-Gai-2 (Abcam) ja kanin anti-Ga13 (Abcam) vasta-aineita. HRP-konjugoitu vuohen anti-kani vasta-aine ostettiin Bioeasytechiltä. Immunoblotit havaittiin tehostetun chemiluminescencen (Thermo Fisher Scientific) avulla, ja kuvia analysoitiin ImageJ-ohjelmistolla.
Kvantitatiivinen PCR
Solujen haluamasi tyypit olivat lajiteltu kanssa FACSAria III ja kohdistuu yhteensä RNA louhinta kanssa RNeasy Plus Mini tai Micro kit (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti., RNA käännettiin All-In-One RT Mastermixilla (Abm). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin qPCR MasterMix-järjestelmällä (Abm) 7500 reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., Suhteellinen ilmaus kohde-geenien eri näytteitä verrattiin normalisoiduttua vastaan ilmaus housekeeping geenien Actb tai Gapdh.
Tilastollinen data-analyysi
Tilastot ja kuvaajat tehtiin Prisma (Graphpad). Ellei toisin mainita, eri ryhmien päätetapahtumamenetelmien vertailussa käytettiin kaksipyrstöisiä oppilaan t-testejä.
Raportointi yhteenveto
lisätietoja tutkimuksen suunnittelu on saatavilla Luonne, Tutkimuksen Raportointi Yhteenveto liittyvät tämän kirjan.