Mikä On Sanger Sekvensointi?
Sanger-sekvensoinnin, joka tunnetaan myös nimellä ”chain termination method”, kehitti englantilainen biokemisti Frederick Sanger kollegoineen vuonna 1977. Tämä menetelmä on suunniteltu määritetään järjestyksessä nukleotidien emäkset pala DNA: ta (yleisesti alle 1000 bp pitkä). Sanger-sekvensointi 99.,99% base tarkkuutta pidetään ”kultakanta” validointi DNA-sekvenssit, mukaan lukien ne, jotka on jo sekvensoitu kautta seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS). Sanger-sekvensointia käytettiin ihmisen Genomiprojektissa määrittämään ihmisen DNA: n suhteellisen pienten fragmenttien sekvenssit (900 bp tai vähemmän). Näistä sirpaleista koottiin isompia DNA-sirpaleita ja lopulta kokonaisia kromosomeja.
Sanger Sequencing VS NGS
NGS Technologiesin kehittäminen on kiihdyttänyt genomiikan tutkimusta. NGS voi samanaikaisesti sekvensoida yli 100 geeniä ja kokonaisia genomeja, joissa on matala DNA., Sanger-sekvensointi on edelleen laajalti käytetty sekvensointi kenttää, sillä se tarjoaa useita merkittäviä etuja: (i) kustannus-tehokkuutta yksittäisten geenien sekvensointi ja (ii) 99.99% tarkkuudella, sopii erityisesti todentaminen sekvensointi sivuston suunnattu mutageenisuus tai kloonattu lisää.
miten Sangerin sekvensointi toimii?
Sanger sekvensointi, DNA-aluke, joka täydentää mallin DNA (DNA sekvensoitiin) käytetään olla lähtökohta DNA-synteesiä., Läsnä neljä deoxynucleotide trifosfaateiksi (dNTPs: A, G, C ja T), polymerase ulottuu pohjamaali lisäämällä täydentäviä dNTP malliin DNA-strand. Määrittää, mikä nukleotidi on otettu osaksi ketjun nukleotidien, neljä dideoxynucleotide trifosfaateiksi (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, ja ddTTP) merkitty eri fluoresoiva väriaine käytetään lopettaa synteesi reaktio. Verrattuna dNTPs, ddNTPs on happiatomiin poistetaan ribonukleotidi, joten ei voi muodostaa yhteyttä seuraavan nukleotidin., Seuraavat synteesi reaktio tuotteet on ladattu neljä kaistaa yhden geeli riippuen erilaisia ketjun päättämisestä nukleotidin ja alistettiin geeli elektroforeesi. Niiden koon mukaan DNA: n sekvenssi määritetään siten.
Kuva 1. Ddntp: n ja dNTP: n rakenne.
Image credit:” Whole-genome sequencing: Figure 1, ” by OpenStax College, Biology).,
Sanger Sekvensointi Vaiheet
Sanger-sekvensointi on menetelmä koostuu 6 vaiheet:
(1) kaksijuosteisen DNA: n (dsDNA) on denaturoitu kahteen yksijuosteinen DNA (ssDNA).
(2) riviin on kiinnitetty aluke, joka vastaa sekvenssin yhtä päätä.
(3) neljä polymeraasiliuosta, joissa on neljä dNTPs-tyyppiä, mutta vain yksi ddNTP-tyyppi lisätään.
(4) DNA-synteesi reaktio käynnistää ja ketju ulottuu siihen asti, kunnes irtisanominen nukleotidin on satunnaisesti otettu.
(5) tuloksena syntyneet DNA-fragmentit denaturoidaan ssDNA: ksi.,
(6) denaturoidut fragmentit erotetaan geelielektroforeesilla ja sekvenssi määritetään.
Kuva 2. Sangerin sekvensointimenetelmä 6-portaisena (mukautettu Gauthier 2008: sta).