Olemme äskettäin käyttänyt CRISPR häiritä Kras-onkogeeni kaksi erillistä keuhkoadenokarsinooma solulinjoja , jotka olivat peräisin Kras G12D; p53-fl/fl (KP) hiirillä . Eristimme kaksi yksisoluista kloonia, joissa jokaisessa oli frameshifting-poistoja ekson 2: ssa (Kuva., 1a ja Lisää tiedosto 1: Kuva S1a): KP1 kantaa 2-nt ”-CG” poistetaan vuonna G12D alleeli ja 1-nt ”-C” poistetaan muutoin villityypin (WT) Kras-alleelia, ja KP2 kantaa 2-nt ”-GG” poistetaan. Kumpikaan klooni ei tuota täyspitkää Kras-proteiinia, mikä viittaa siihen, että kaikki kolme poistoa häiritsevät Kras-lukukehystä.
sgRNA kohdistaminen Kras aiheuttaa eksonin ohita yhden solun klooneja. kaavamainen Sgrna kohdistetaan Exon 2 hiiren Kras geeni (sgras)., Punainen nuolenkärki tarkoittaa Cas9-pilkkopintaa. KP1 ja KP2 solulinjat olivat transduced kanssa lentivirus, joka koodaa Cas9 ja sgKras. Kaksi yksisoluista kloonia (KP1-klooni ja KP2-klooni) harbor frameshift-poistoja. Mustat nuolet osoittavat käänteisen transkription polymeraasiketjureaktion (RT-PCR) alkulukujen asemat. G12d-koodonia alleviivataan. b Normalisoitu Kras lukea laskee RNA-sekvensointi (RNA-seq) analyysi KP vanhempien soluja (sininen) ja KP-klooneja (punainen). RNA-seq tehtiin kahdesti KP2-kloonille ja kolmesti muille ryhmille. ”+”tarkoittaa WT alleelia., C RNA-seq osoittaa osittaista ekson 2-skippausta KP1-klooneissa. RNA-seq-numerot osoittavat lukemia, jotka ulottuvat ilmoitettuihin eksoniitteihin. Kaksi edustavaa biologista replikaattia on esitetty. D RT-PCR analyysi Kras mRNA havaitsee exon 2 ohitettu bändi. Odotetut kaistakoot ovat 331 bp ja 209 bp. M, molekyylimerkki. ”*”tarkoittaa indels PCR tuotteita klooneja. E Scatter juoni näyttää 22 exon tapahtumia, jotka muuttuvat sekä KP1 ja KP2 klooneja. Kras exon 2: n poissulkeminen on yleisin tapahtuma., Ψ, Prosenttiosuus Liitos-Indeksi
Frameshift-mutaatioita alussa eksonien ovat tunnettuja laukaista nonsense-välitteinen hajoaminen (NMD) , joka eliminoi mRNAs ennenaikainen irtisanominen kodonien. Kun analysoimme mRNA-sekvensointi (RNA-seq) tiedot, kuitenkin, huomasimme, että näennäinen Kras-mRNA tasot (eli yhteensä normalisoitu lukee mRNA) olivat vain alennetaan 19% KP1 soluja ja 47% KP2 soluja, verrattuna vanhempien KP-solujen (Kuva. 1 B). Molemmat kloonit tuotettu vähemmän eksonin 2 lukee, mutta normaalin eksonin 1 ja 3 lukee (Fig., 1c), mikä viittaa siihen, että eksonin 2 voidaan ohittaa KP1 ja KP2 klooneja. Itse asiassa havaitsimme exon 1-3 junction reads, mikä osoittaa, että exon 2 jätettiin väliin(Kuva. 1c ja lisätiedosto 1: kuva S1b). Laskeminen suhde eksonin 2 lukee ja lukee yhteensä, huomasimme, että eksonin 2 on mukana vain 64.0 ± 9,1% Kras lukee KP1-klooni (Fig. 1c ja taulukko 1). Vastaavia eksonin 2 ohita havaittiin KP2-klooneja (Lisää tiedosto 1: Kuva S1c)., Siispä, käänteinen transkriptio Kras-mRNA seuraa polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) tuotti kaksi tuotetta: yksi vastasi ehjä Kras täydentäviä DNA (cDNA) ja toinen vastasi eksonin 1-3-isoentsyymin (Fig. 1d). Se eksonin 1-3-isoentsyymin säilyttää osittaisen Kras-open reading frame, joka voisi aloittaa käännös on ATG-kodoni eksonin 3 (Lisää tiedosto 1: Kuva S2) ja tuottaa ankarasti typistetty Kras-proteiinia.,
Editointi Kras ei aiheuttanut vaihtoehtoisen silmukoinnin genome-wide. Tunnistimme 97 vaihtoehtoisesti yhdistettyä eksonia KP1-soluissa ja 177 tapahtumaa KP2-soluissa. KP1 ja KP2 klooneja jaettu 22 kasetti osallisuuden tai syrjäytymisen tapahtumia, lukuun ottamatta Kras eksonin 2 on suurin muutos, sekä kloonit (Fig. 1e ja lisätiedosto 1: taulukko S3). Näin, editointi Kras eksonin 2 erityisesti aiheuttama ohita Kras eksonin 2., Erityisesti, kun hiiri Kras G12D (GGU, jotta GAU) selostukset älä ohita eksonin 2 vanhempien KP soluja, huomasimme, että ~15% ihmisen KRAS G12S (kodonissa 12 GGU että AGU) selostukset ohittaa eksonin 2 A549 ihmisen lung cancer cell line (Lisää tiedosto 1: Kuva S1d). Emme voineet ennustaa voitto tai tappio eksonin liitos parantajia tai äänenvaimentimia , mutta meidän tiedot viittaavat siihen, että sekvenssit lähellä Kras kodonissa 12 edistää eksonin 2 sisällyttämistä hiiren ja ihmisen Kras-geeniä. CRISPR-muokkauksen aiheuttama ekson skippaus ei rajoittunut Kras-tai hiiren KP-soluihin., Tuore tutkimus osoitti, että CRISPR editointi FLOT1 eksonin 3 HeLa-solut voivat aiheuttaa ohita eksonin 3, eksonin 4, tai eksonien 3, 4, ja 5 . Meillä on myös havaittu harvoin eksonin ohita kun me kohdennettuja eksonin 11 LMNA ihmisen HCT116 solut (Lisää tiedosto 1: Kuva S3). Ohittaminen LMNA exon 11 tuottaa kehyksellisen transkriptin, joka voitaisiin kääntää neomorfiseksi proteiiniksi.
edelleen tutkia ajatusta, että eksonin ohita voisi tuottaa toiminnallinen runko transkriptio, kysyimme, onko CRISPR-välitteisen editointi Ctnnb1 eksonin 3 saattaa aiheuttaa eksonin ohita ja aiheuttaa gain-of-function fenotyyppi., Eksonin 3 Ctnnb1 koodaa phosphoacceptor jäämiä, jotka edistävät hajoamista β-Catenin transkriptio tekijä ; geneettinen excision Ctnnb1 eksonin 3, joka on kehyksen kanssa eksonin 4—stabiloi konstitutiivisesti aktiivinen β-Catenin, joka kerääntyy ydin . Suunnittelimme 11 sgRNAs, että kohde-alueilla sekä Ctnnb1 eksonin 3 (Ctnnb1-sg1-to-sg11), transduced yksittäisten sgRNAs osaksi KP-soluja, ja käyttää korkea suoritusteho sekvensointi analysoida, missä määrin editointiin sgRNA kohteesta kunkin rivin (Kuva. 2B X-akseli, lisätiedosto 1: kuva S4 ja lisätiedosto 2: taulukko S4)., Kolme sgRNAs (sg6, sg9, ja sg10) tehottomasti kohdennettu Ctnnb1. Kahdeksan Ctnnb1 sgRNAs (sg1, jotta sg5, sg7, sg8, ja sg11), kuitenkin, aiheuttama indels niiden kohde-sivustot taajuuksilla, jotka ylitti 20%. Esimerkiksi, Ctnnb1-sg1 syntyy + T lisäyksiä noin 65% lukee (Fig. 2 C). Jokaisessa vahvan ctnnb1 sgRNA: n kohteena olevassa populaatiossa havaitsimme kolme RT-PCR-tuotetta, jotka kattavat 2-5 (Kuva. 2D). Päätuote vastaa normaalisti liitettyä transkriptiota, joka sisältää exon 3: n. Kaksi muuta tuotetta vastaavat vaihtoehtoisesti yhdistettyjä selosteita: yksi, joka hyppää exon 3 (ts., exon 2-4 splicing, Kuva. 2e) ja joka hyppää sekä eksonit 3 että 4 (eli ekson 2-5 splicing, Kuva. 2 F). Ctnnb1 sgRNAs kohdistaminen joko DNA-juosteen aiheuttama eksonin ohita ja Cas9 nuclease toiminta oli välttämätöntä eksonin ohita (Fig. 3 A).
Ctnnb1 sgRNAs kohdistaminen eksonin 3 indusoi eksonin ohita. Ctnb1-geenin kaavamainen. In-runko eksonin 3 koodaa estävä domain: fosforylaation aminohappoja, 33, 37, 41, ja 45 edistää hajoaminen β-Catenin proteiini., Ekson 3: n häviäminen stabiloi β-Kateniinia. Yksitoista sgrnaa oli suunniteltu kohdistamaan ekson 3: vahvat sgrnat punaisiin ja heikot sgrnat mustiin. sgRNAs, jotka käyttävät ”NGG” PAM on esitetty edellä eksonin 3 ja ne, jotka käyttävät ”CCN” PAM on esitetty alla eksonin 3. B korrelaatio Exon 3-skippauksen ja sgRNA-tehokkuuden välillä. Genomiset indelit mitattiin syväsekvenssillä. KP-solut saivat tartunnan lentiviruksesta. Exon 3 skipping efficiencies are from (d). Sg11: n indellejä ei määritetty. > 20% indellejä indusoivat sgrnat on merkitty punaisella., c Jakelu sg1 indels osoittaa, että T lisäys (+T) klo Cas9 katkaisukohdan nukleotidin 97 eksonin 3 (punainen nuolenkärki) oli yleisin. Pam-sarja on sininen. D RT-PCR käyttäen primers spanning exons 2 ja 5 osoittaa osittainen exon skipping. Molekyylimarkkeri. sggfp on control sgRNA. Eksonin 3 ohita bändit olivat määrällisesti käyttäen ImageQuant TL-ohjelmisto ja normalisoitu täyspitkä cDNA bändejä. sg4: ssä oli näkyviä heikkoja nauhoja, joita ei voitu määrittää., e -, f-TOPO kloonaus ja Sanger sekvensointi vahvisti, että kaksi suurta alempi RT-PCR-bändejä (c) ovat vaihtoehtoinen silmukointi eksonin 2-4 ja eksonin 2-5, vastaavasti. g Western blot-analyysi β-Cateniinista. Täyspitkä β-Catenin on ~86 kD. β-Kateniini ilman eksonia 3 (delta exon 3) on ~77 kDa. Aktiini toimi kuormituksen valvonta
Cas9 nuclease toimintaa tarvitaan ohita yksi tai useampi eksonien., RT-PCR-analyysi Ctnnb1 mRNA: n KP-solujen transduced kanssa lentivirusten, että koodata sgCtnnb1.2 ja nuclease-viallinen Cas9 (dCas9), dCas9-KRAB fuusio -, tai WT-Cas9. RT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita vuonna eksonien 2 ja 7 transduced KP solupopulaatioissa jälkeen puromycin valinta ja FACS lajittelu. Eksonin pituus ja lukukehysvaihe näkyvät. Vain ekson 2-4-liitosvalmiste säilyttää kehyksellisen β-Kateniinin koodausjärjestyksen. b-RT-PCR-analyysi Ctnnb1 mRNA: n KP-solujen transduced kanssa lentivirusten, että koodata Cas9 ja sgGFP, sg3, tai sg5., ”–”hoitamaton
Western blot-analyysi osoitti, että solujen populaatioita transduced vahva sgRNAs tuottaa pienempiä ~74 kD β-Catenin proteiini, joka vastaa kooltaan että odotetaan eksonin 2-4 tuote liitos (Kuva. 2g). Kokopitkä β-Kateniiniproteiini ei ollut merkittävästi tyhjentynyt neljän päivän kuluttua transduktiosta. Testata, onko vaihtoehtoisen silmukoinnin on riippuvainen jatkuva ilmaus Cas9 tai sgRNA vuonna lentiviral vektorit, me co-transfektoiduissa Cas9 ja Ctnnb1-sg1 tai ei-kohdistaminen sgRNA ohjaus., Seitsemän päivää transfektion jälkeen, kun transfektoiduissa Cas9 ja opas RNAs pitäisi olla tyhjentynyt, olemme tutkineet β-Catenin lokalisointi immunofluoresenssilla. Hiiren fibroblasti-solut transfektoiduissa ei kohdistaminen ohjaus sgRNA, β-Catenin lokalisoitu solun liittymissä (Lisää tiedosto 1: Kuva S5a). Sen sijaan monissa soluissa transfektoiduissa Ctnnb1-sg1, me havaittu β-Catenin tumassa (Lisää tiedosto 1: Kuva S5a)., Nämä tulokset viittaavat siihen, että jatkuva muokkaus ei vaadita eksonin ohita ja että eksonin 3 ohita aiheuttama CRISPR-välitteisen editointi Ctnnb1 eksonin 3 tuottaa gain-of-function-β-Catenin-isoentsyymin.
Me analysoidaan edelleen selostukset ulottuu eksonien 2 7 solupopulaatioissa käsitelty Ctnnb1-sg2, -sg3, ja -sg5. Lisäksi koko-pituus-isoentsyymin kautta, voimme havaita neljä selostukset kanssa eksonin 2 ilmeisesti saumattu kunkin loppupään eksonin (eli eksonin 2-4, eksonin 2-5, eksonin 2-6, ja eksonin 2-7; Fig. 3 A, b)., Emme ymmärrä mekanismia ilmeisesti siveetön eksonin ohita aiheuttama Ctnnb1 eksonin 3 muokkaus, emmekä ole voineet korreloida siveetön eksonin ohita tiettyjä kohteita tai indel mutaatioita eksonin 3. Eristimme kuitenkin ctnnb1-sg3-muokatun kloonin, joka viittaa mahdolliseen mekanismiin (lisätiedosto 1: kuva S6A). Tämä biallelic klooni sisältää 3-bp-runko poistetaan yksi alleeli ja suuri 832-bp poistaminen, toisaalta; 832-bp poistetaan sulakkeet 5′ pää introni 2 3′ loppuun eksonin 4 (Lisää tiedosto 1: Kuva S6)., Havaitsimme kaksi selostukset näissä soluissa: asianmukaisesti saumattu transkriptio, joka sisältää 3-bp poistaminen ja transkriptio, joka sisältää introni 2 fuusioitu eksonin 4 (Lisää tiedosto 1: Kuva S6c ja Taulukko 1). Nämä tulokset viittaavat siihen, että näennäinen eksonin ohita havaittu populaatioiden muokata soluja voisi heijastaa genomin uudelleenjärjestelyjä, joka poistaa eksonien.
Kaksi kokeiluja ajatusta, että yhden sgRNA voi aiheuttaa suuria genomista poistot, jotka poistavat eksonien., Esimerkiksi, me eristetty 15 klooneja hiiren 3T3-solujen ohimenevästi transfektoiduissa Cas9 ja Ctnnb1-sg1, ja totesi, että neljä klooneja (eli klooneja 4, 5, 13 ja 15) osoitti ilmeistä eksonin ohita mukaan RT-PCR-menetelmällä. Genomista PCR paljasti genomin uudelleenjärjestelyt kolme näistä klooneista: suuret poistot (>500 bp) ja pienempiä poistoja (~100 bp) vuonna klooneja 4 ja 15, ja suuret lisäykset klooneja 13 ja 15 (Lisää tiedosto 1: Kuva S7)., Lisäksi, kun kohdistaminen eksonin 6 p65/Re, me eristetty biallelic p65 klooni (#15): yksi alleeli, satamat 1-nt ”+A” lisäys ja muut satamat 2268-bp poistaminen, joka poistaa eksonien 5, 6, ja 7 (Lisää tiedosto 1: Kuva S8a, c–e). Vuonna p65 klooni #15, voimme havaita täysin saumattu transkriptio ja eksonin 4-8 liitos tuotteen (Lisää tiedosto 1: Kuva S8c). Molemmat alleelit koodaavat frameshiftattuja transkriptejä ja molemmat p65-transkriptejä ovat WT: tä pienemmillä tasoilla (lisätiedosto 1: kuva S8B)., Meillä on myös eristetty muokattu p65 klooni (#31) homotsygoottisia sama + lisäys kuten klooni #15, mutta klooni #31 ei tuota vaihtoehtoisesti saumattu selostukset. Niinpä eksoni 4-8 yhdistettiin transkripti klooni #15: ssä eksonien 5, 6 ja 7 poistosta. Nämä suuret ekson deleetiotapahtumat olivat odottamattomia, ja ne jäisivät huomaamatta tyypillisten PCR – pohjaisten seulontatestien avulla.,
kyky aiheuttaa gain-of-function toimintaa aiheuttamalla eksonin ohita tai eksonin leikkaaminen ehdotti, että CRISPR-meditoi editointi yhdellä sgRNA saattaa olla hyödyllinen tapa osittain pelastus toiminto taudin geeni, joka vaatii matalan tason pelastus. CRISPR-välitteisen homologisia DNA: n korjaukseen on käytetty oikea ennenaikaisen stop-kodonin mutaatioiden Dmd geeni hiiren malli DMD ja useat ryhmät ovat käyttäneet CRISPR poistaa Dmd eksonien ja osittain palauttaa Dmd ilme . Suunnittelimme neljä sgRNA/Cas9 lentivirusten, että kohde eri sivustoja eksonin 23 Dmd-geenin (Fig., 4a, b) ja transduced hiiren C2C12 myoblasts, solu line laajalti käytetty mallina Duchennen lihasdystrofia (DMD) . Vuonna C2C12-solujen transduced kanssa Dmd sgRNAs, havaitsimme RT-PCR-tuote, joka vastaa normaalia liitos tuote, joka sisältää eksonin 23. Sekvensointi nämä RT-PCR-tuotteiden kävi ilmi, että vain Dmd-sg2 tehokkaasti muokata Dmd eksonin 23, mistä on osoituksena sekoittaa järjestyksessä huiput yli sgRNA kohteesta (Lisää tiedosto 1: Kuva S9). Soluissa transduced kanssa Dmd-sg2, meillä myös havaittu RT-PCR-tuote, joka vastaa eksonin 22 saumattu eksonin 24 (Fig. 4c, d)., Näin kohdistaminen eksonin 23 yksi sgRNA voi olla riittävä aiheuttamaan osittainen eksonin ohita ja tuottaa ehjä dystrofiini open reading frame. DMD on klassinen esimerkki taudista, jossa pieni määrä toiminnallisia palauttaminen voi tarjota merkittävää kliinistä hyötyä .
On sgRNA kohdistaminen eksonin 23 Dmd voi osittain palauttaa in-frame dystrofiini mRNA: ta. Kaavamaisen sgRNA kohdistaminen ja hyppivä hiiri, Dmd eksonin 23 ja sijainti alukkeet RT-PCR-analyysi., Exon 23: n ohittaminen luo mRNA: n kehykseen. b sgRNA kohdepaikat Dmd exonissa 23. c RT-PCR-analyysi hiiren C2C12 myoblast solujen transduced kanssa lentivirusten, että koodata Cas9 ja sgDmd1, 2, 3, tai 4. Odotetut kaistakoot ovat 353 bp ja 140 bp. Molekyylimarkkeri. d Sekvenssin analyysi 140-bp cDNA-yhtye sgDmd2-käsiteltyjä soluja vahvisti liittämiseen eksonin 22 eksonin 24