Sanger Sequencing 이란 무엇입니까?
Sanger sequencing 은”chain termination method”라고도 알려져 있으며 1977 년 영국의 생화학 자 Frederick Sanger 와 그의 동료들에 의해 개발되었습니다. 이 방법은 DNA 조각(일반적으로 길이가 1,000bp 미만)에서 뉴클레오티드 염기의 서열을 결정하기 위해 고안되었습니다. 생어 시퀀싱 99.,99%염기 정확도는 차세대 시퀀싱(ngs)을 통해 이미 시퀀싱 된 것을 포함하여 DNA 서열을 검증하기위한”황금 표준”으로 간주됩니다. Sanger sequencing 은 인간 게놈 프로젝트에서 인간 DNA 의 비교적 작은 단편(900bp 이하)의 서열을 결정하기 위해 사용되었습니다. 이 조각들은 더 큰 DNA 조각과 결국 전체 염색체를 조립하는 데 사용되었습니다.
Sanger Sequencing VS NGS
NGS 기술의 발전으로 유전체학 연구가 가속화되었습니다. NGS 는 저 입력 DNA 로 100 개 이상의 유전자와 전체 게놈을 동시에 서열화 할 수 있습니다., 생어 시퀀싱 남아에서 널리 이용되는 시퀀싱 분야로 그것이 제공하는 여러 가지 눈에 띄는 장점:(i)비용 효율적인 시퀀싱을 위한 하나의 유전자 및(ii)99.99%정확도,특히 적합한 인증 시퀀싱에 대한 mutagenesis 사이트 또는 복제 삽입합니다.
Sanger 시퀀싱은 어떻게 작동합니까?
Sanger 시퀀싱에서 템플릿 DNA(시퀀싱 될 DNA)에 상보적인 DNA 프라이머가 DNA 합성의 출발점으로 사용됩니다., 4 개의 데 옥시 뉴클레오티드 트리 포스페이트(dNTPs:A,G,C 및 T)의 존재 하에서,중합 효소는 상보적인 DNTP 를 템플릿 DNA 가닥에 첨가함으로써 프라이머를 연장시킨다. 을 결정하는 뉴클레오티드로 통합된 체인의 뉴클레오티드,네 dideoxynucleotide triphosphates(ddNTPs:ddATP,ddGTP,ddCTP 및 ddTTP)라는 독특한 형광성 염료에 사용되는 종료 합성 반응이다. Dntps 와 비교하여 ddNTPs 는 리보 뉴클레오타이드에서 제거 된 산소 원자를 가지므로 다음 뉴클레오타이드와의 연결 고리를 형성 할 수 없습니다., 다음과 같은 합성,반응 제품으로 로드되는 네 개의 차선의 단순한 젤에 따라 다양한 체인 종료 뉴클레오티드와 실시 겔 전기 영동법입니다. 그들의 크기에 따라,DNA 의 서열은 따라서 결정된다.
그림 1. DdNTP 와 dNTP 의 구조.
이미지 제공:”전체 게놈 시퀀싱:그림 1,”By OpenStax College,Biology).,
생어 시퀀싱 단계
생어 시퀀싱 방법에 의하여 이루어져 있는 6 단계:
(1)DNA 의(dsDNA)는 변성된 두 가지로 하나의 가닥 DNA(ssDNA).
(2)서열의 한쪽 끝에 해당하는 프라이머가 부착된다.
(3)4 가지 유형의 dNTPs 가 있지만 한 가지 유형의 ddNTP 만있는 4 가지 중합 효소 용액이 첨가됩니다.
(4)DNA 합성 반응이 시작되고 종단 뉴클레오타이드가 무작위로 혼입 될 때까지 사슬이 연장된다.
(5)생성 된 DNA 단편은 ssDNA 로 변성된다.,
(6)겔 전기 영동에 의해 변성 된 단편이 분리되고 서열이 결정된다.
그림 2. 6 단계의 생어 시퀀싱 방법(Gauthier2008 에서 적응).