Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174 불충분 한 쥐들에 의해 생성되는 표준 유전자를 대상으로 절차를 대체하 Gpr174 오픈 프레임을 읽으로 LacZ/네오 카세트를 사용하 129SvEvBrd 미발달 줄기 세포 라인(Texas A&M 연구소는 유전체의학,TG0128). 이들 GPR174-결핍 마우스는 12 세대 동안 C57BL/6 마우스로 역 크로싱되었다. C57BL/6 배경상의 관련 마우스를 gfp-발현 MD4 마우스 및 dsRed-발현 GPR174-충분 또는-결핍 MD4 마우스를 얻기 위해 교배시켰다., 6 주에서 12 주 사이의 연령과 표시된 남녀 사이의 연령 일치 리터 메이트가 실험에 사용되었습니다. 마우스 실험을위한 샘플 크기를 경험적으로 결정하고,마우스를 대조군 또는 실험군에 무작위로 배정 하였다. 여기에 제시된 마우스 실험에는 눈을 멀게 할 필요가 없었습니다. 모든 쥐었지 특정-병원체는 조건에 따라 사용되었으로 정부와 청화 기관의 동물 보호와 사용 위원회 지침서에 대한 동물 복지입니다.,
GPR174GFP BAC 유전자 변형 쥐
시퀀스를 코딩을 위한 글리신–글리신–글리신 떠들고(GGGS)linker(네 번 반복)및 향상된 GFP(EGFP)삽입되기 전에 즉시 중지 codon 의 GPR174 오픈 프레임을 읽고 마우스의 BAC 클론 RP23-206J14 여 동종 재조합. 변형 된 BAC 를 정제하고 수정 된 ova 의 pronuclei 로 미세 주입하여 형질 전환 기자를 생성 하였다. 혈액에서 GFP 발현 B 세포에 대해 양성 선별 된 설립자 마우스를 사용하여 Gpr174–GFP BAC 균주를 확립하기 위해 B6 마우스와 더 번식시켰다.,
셀 문화,레트로바이러스에 체외 전달
순 T 세포나 세포에 고립되었을 사용하여 부정적인 CD4T-cell 격리 장비 또는 순 B-세포의 격리 장비(Miltenyi Biotec)에 따르면 제조업체의 프로토콜. Overexpress 대상 유전자 B 세포에서,정제의 B 세포 활성화되었으로 1µg ml−1lipopolysaccharide(시그마)를 1 일 전에는 스핀에 감염된 retroviral supernatants 에서 1,500g2h,로 described18.
골수 키메라의 건설
b6 수신자 마우스를 x 선으로 치명적으로 조사 하였다(5.,3×106 성 일치 골수 세포의 정맥 내 전달을 제공 한 후 80%μmt 세포와 20%GPR174-충분 또는 결핍 세포로 구성되었다. 키메라는 재구성 후 6 주에서 8 주 후에 실험에 사용되었습니다.
생식선 절제술
이유 후 마우스를 avertin(2.5%,0.015ml g−1 체중)으로 복강 내 마취시켰다. 암컷 쥐의 난소 절제술을 위해 양측의 난소를 노출시키고 양측 등쪽 절개를 통해 제거 하였다., 수컷 쥐의 난초 절제술의 경우,양측의 고환을 노출시키고 제거하기 위해 중간 복부 절개를 하였다. Sham-operated control 쥐 수술을 포함하여 양자 등의 절개 또는 중앙값 복 절개를 제거하지 않고 난소 또는 고환. 수술 상처 개구부를 봉합하고 항생제 및 진통제를 국소 적으로 도포 하였다. 생쥐는 후속 실험 전에 8 주 동안 회복 할 수있었습니다.,
테스토스테론 치료
여섯 여덟-week-old 쥐 피하 주사 테스토스테론(kg10mg−1 체중)에 용해 해바라기씨유 다른 모든 일에 대한 두 개의 주입니다. 비히클 대조군 마우스를 해바라기 씨 오일 단독으로 처리 하였다.
입양 전송,예방접종 및 바이러스 감염
을 측정하는 새싹 센터에 의해 형성 MD4B 셀,105OT-II T 세포 및 5×105MD4B 세포의 표시 genotypes 었 정맥 투여 전송으로 남성 B6 받는 사람이었고,그 후 접종 피하와 함께 0.,명반에서 5μg 리포 폴리 사카 라이드 및 30μg HEL-OVA 공액 항원(Thermo Scientific). HEL-OVA 는 이전에 설명 된 바와 같이 HydraLink conjugation kit(SoluLink)와 화학적 가교에 의해 만들어졌다 19. 을 측정하는 새싹 센터 형성이 응답하여 SRBC 예방 접종 또는 림프구 choriomeningitis 바이러스(LCMV)감염,마우스 주입하고 intraperitoneally5×108SRBCs(에서 Z.Baiji)또는 2×105 패-를 형성하는 단위의 LCMV 바이러스 암스트롱(L. 너희와 R.Ahmed).,
EAE by MOG 단백질 예방접종
순서 인코딩은 첫 번째 120 아미노산의 인 MOG 었에 의해 증폭된 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 인간의 뇌를 보완 DNA 라이브러리,그리고 복제 사 NdeI 및 XhoI 사이트의 pET22b+expression vector(발현량). 인간 MOG 단백질은 BL21(DE3)Escherichia coli 에서 발현되었고,그의 카르복시 말단 히스티딘(His)태그에 의해 정제되었다. 단백질 순도 및 농도는 각각 SDS–PAGE 및 bicinchoninic acid(bca)protein assay 에 의해 평가되었다. 재조합 단백질은 사용할 때까지 -80°C 에서 저장되었다., 을 유도하 EAE,bone-marrow-chimeric 동물의된 종류의 접종 피하에서 측면과 200µg recombinant human MOG 단백질 유화에 완벽한 프로 인트의 보조에 날 0. 마우스를 0 일 및 2 일에 백일해 독소(Invitrogen)200ng 로 정맥 주사 하였다. 마우스를 1 일째부터 질병 진행에 대해 맹검 방식으로 매일 모니터링 하였다. 질병 엄격으로 득점은 다음과:0,임상적 징후;1 마비,tail;2,손실의 움직임을 조정하고 마비의 뒷다리며,2.5,마비의 뒷다리를;3,마비의 뒷다리;3.,5,뒷다리의 마비와 앞다리의 약점;4,앞다리의 마비;및 5,사병. 을 비교하는 질병 엄격,우리가 공부하 열 쥐당 상태별 실험,그리고 분석하는 질병의 점수와 함께 시간을 통해 두 방법으로 ANOVA.
cytometry
측정 antigen-specific 항체 상부 그리고 역가
을 측정하 SRBC-특정 항체 상부 그리고 역가,우리 lysed5×108SRBCs1ml 더블 증류 물과 원심 분리하여 그들에 15,000r.p.m 입니다. 20min., 의 펠렛 resuspended 에 PBS 에서 사용하는 코트 MaxiSorp 효소결합 면역 분석법(ELISA)판(Nunc Maxisorp)에서 하룻밤 4°C 을 측정하 MOG-특정 항체 혈청,우리가 사용 2µg ml−1 정화 recombinant human MOG 코트 ELISA 니다. 비특이적 바인딩으로 차단 1%소 혈 청 알부민(BSA)PBS 에서와 Tween-20 일(PBST)2h37°C 에 의해 다음,부화와 2×시리얼 희석의 청 샘플의 예방 접종 쥐 1h37°C, 접시 세척 및 배양 고추냉이 peroxidase(HRP)-활용 anti-mouse IgG 보조 항체(1/20,000)1h37°C. 접시 세척,개발 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(TMB)및 중지 1M HCl. 우리는 빈 우물을 0 으로 설정하고 450nm 에서 흡광도를 기록했습니다. 우리는 면역되지 않은 마우스의 sera 를 음의 대조군으로 사용했다;컷오프 값은 음의 대조군의 450nm(OD450)에서 2.1 을 곱한 광학 밀도였다. 컷오프 값보다 적은 OD450 값을 갖는 우물은 양성으로 간주되었다., 양성을 준 샘플의 가장 높은 희석은 샘플의 역가입니다.
배포의 B 세포 기술에 의해
에 대한 다양한 실험,순진 B 셀,B 세포 활성화를 위해 1 시간 10µg ml−1F(ab)2goat anti-mouse IgM(잭슨 Immunoresearch),또는 나를 세포로 불리고 레트로 이송되었으로 B6 수 있습니다. 필요한 경우,이들 세포를 1μm 테트라 메틸 로다 민(TAMRA),4-클로로 메틸-6,8-디 플루오로-7-히드 록시 쿠마린(CMF2HC)또는 5-클로로 메틸 플루오 레세 인 디 아세테이트(CMFDA)(Invitrogen)로 라벨링 하였다., 비 또는 서혜부 림프절을 받는 사람의 마우스로 수정되었 1%파라포름알데히드를 위한 12h 다음에 탈수 30%자당한 솔루션 12h 에서 4°C 로을 최대 표현한 다른 기관에서 지역 최종 데이터 집합,우리가 처리되는 비연속적인 조직 섹션과 스테인드 그들과 함께 지체입니다. 염색 시약에는 eFluor450-IgD(eBioscience),APC-CD35(BD),PE-CD3(BD),eFluor450-B220(eBioscience),rabbit anti-GFP(abcam)및 AF488goat anti-rabbit IgG(Invitrogen)가 포함되었습니다., 슬라이드를 ProlongGold Antifade 시약(Invitrogen)으로 장착하고 Olympus FV1000 직립 현미경으로 검사했습니다. 이미지는 Imaris(Bitplane)및 ImageJ1.46r(국립 보건원)으로 분석되었습니다.
비장 기질 준비
비에서 생쥐,쥐 또는 돼지가 반복해서 누르고 지상에 대해 금속 메쉬를 해제 적혈구 세포. 나머지 unsuspendable,amorphic stromal 조직 요소를 b27 혈청없는 배양 배지(Invitrogen)에 넣기 전에 pbs 로 철저히 세척하고 37°c 에서 12 시간 동안 배양 하였다., 생쥐의 경우,3 마리의 동물로부터의 stromal 요소를 1ml 배지에서 배양 하였다. 돼지의 경우,1 개의 비장으로부터의 stromal 요소를 80ml 로 배양 하였다. 결과 문화가 원심 분리에서 10,000r.p.m 입니다. 60min 을 얻련 매체는데,이는 즉시 사용되는 실험 또는 냉동 -20°C 까지 사용이다.
Transwell 분석
B 세포 활성화 1µg ml−1lipopolysaccharide60 서 사용되었을 분석하고,다른 분수에서 유래 생화학적 분류., Ccl21 유도 이동을 분석하기 위해 10μg ml−1F(ab’)2 염소 항 마우스 IgM(Jackson Immunoresearch)및 10μg ml-1 항 CD40(clone FGK4.5,Bio X Cell)으로 활성화 된 Naive b 세포 또는 B 세포를 사용 하였다. 을 때의 B 세포는 다른 유전자형을 비교,적어도 세 가지 기증 마우스의 각각의 유전자 치료하는 데 사용되었 격리 B 세포에서 각각의 실험,그리고 어린 친구들은 항상 사용됩니다. B 세포를 밀리리터 당 106 개의 세포에서 현탁시키고 1 시간 동안 37°C 에서 1%FBS 를 함유하는 RPMI 배지에서 휴식하였다., 다음의 총 100µl 셀 서스펜션이 추가되었 상 챔버에서 5μm-공 Transwell(코닝 코스타),의 총 150µl 유인-포함하는 솔루션이 추가되었단다. 이러한 솔루션이 포함되어 있습니다 문화 중간에 세련된 원 마우스 비장 기질 준비,문화 중간에 세련된 원 돼지 비장 기질 준비,도비 분수에서 크로마토그래피,문화를 포함하는,재조합 CCL21 및 CCL19(Peprotech),또는 18/0 년 LysoPS(Avanti 북극 지질)의 농도 표시., 일부에 대한 실험,murine 기질된 매체가 처음으로 보충된 최종 농도의 5µg ml−1 중화 항체 마우스 CCL21 또는 CCL19(R&D 시스템)또는 goat IgG isotype control,and incubated4°C,3 시간 전에 사용되는 transwell 분석하지 않아도 됩니다. 항체 용량은 예비 실험에서 결정된 바와 같이 100ng ml−1CCL21 또는 CCL19 를 중화시키기에 적어도 충분했다. 세포는 인큐베이터에서 37°c 에서 3h 동안 transmigrate 할 수 있었다., 세포는 마이그레이션 하단 웰에 열거된 cytometry,형광 A20 세포의 알려진 숫자의 즉시 추가 읽기 전에는 내부 계산 표준입니다. 각 조건은 달리 명시되지 않는 한 삼중 우물에서 측정되었다.
생화학적 분류
크로마토그래피었를 사용하여 수행되는 ÄKTApurifer10 단백질을 액체 크로마토그래피(FPLC)시스템(GE Healthcare)4°C 을 제외하고,마지막 단계는 사용하여 수행된 ÄKTAmicro FPLC 시스템(GE Healthcare)., 완충 I(25mM Hepes,pH7.0)와 평형 된 음이온 교환 컬럼(250ml bed volume)에 총 1,200ml 돼지 stroma-conditioned 배지를 적용 하였다. 열은 1m NaCl 로 보충 된 버퍼 3 열 볼륨으로 용출되기 전에 3 열 볼륨으로 세척되었습니다. 의 흐름을 통해이었 버퍼 변경으로 버퍼 II(25mM Tris-HCl,pH8.5)100ml 다시 적용되는 음이온 교환 열 equilibrated 버퍼 II. 열었다로 세척한 두 개의 열을 볼륨의 버퍼 II 고 용출 가진 두 개의 열을 볼륨의 0.1–0.5M 선형 NaCl 그라데이션합니다., 각각 10ml 의 분획을 수집하였고,aliquots 는 transwell 분석법에 대해 RPMI1640 으로 완충 변화시켰다. Active 분수 풀링 및 버퍼 변경으로 10ml 버퍼 II 드에 헤파린 칼럼(5ml 침대 볼륨)equilibrated 버퍼 II. 열 세정 12 열 볼륨의 버퍼 II 고 용출으로 4 열의 볼륨 0-2M 선형 NaCl 그라데이션합니다. 각각 2ml 의 분획을 수집하고,aliquots 를 transwell assay 에 대해 RPMI1640 으로 완충 변화시켰다. 활성 분수는 다시 풀링되고 버퍼-0 으로 변경되었습니다.,5ml 버퍼에 나와드에 Superdex-75 칼럼(24ml 침대 볼륨)equilibrated 버퍼 I. 열었음 용출로 하나의 열량의 버퍼 I. 분의 0.5ml 를 각각의 수집 및 분취었 버퍼 변경된 경우 1640 에 대한 transwell 분석하지 않아도 됩니다. Active 분수 풀과 집중으로 0.5ml 로드에는 모노 S column(1ml 침대 볼륨)equilibrated 버퍼 I. 열었으로 세척 12 열 볼륨의 버퍼가 및 eluted25 열 볼륨의 0-0.5M 선형 NaCl 그라데이션합니다., 각각 1ml 의 분획을 수집하였고,aliquots 는 transwell 분석법에 대해 RPMI1640 으로 완충 변화시켰다. Active 분수링 버퍼 변경과 집중으로 50µl buffer 나와드에 모노 S 열 equilibrated 버퍼 I. 열었으로 세척 세 열 볼륨의 버퍼 포함하는 0.3M NaCl 고,eluted24 열 볼륨 0.3–0.4M 선형 NaCl 그라데이션합니다., 의 단수는 1ml 를 각각의 수집 및 분취었 버퍼 변경된 경우 1640 최종 transwell 분석 결과를 식별하는 부분 포함된 가장 강력한핵세포화학유인물 활동입니다.
질량 분석
마지막 정제 단계로부터의 분획을 50μl 로 농축시키고 12%NuPAGE 겔(Invitrogen)에서 분석 하였다. 젤은 제조업체의 프로토콜에 따라 질량 분석 용 피어스 실버 얼룩(Thermo Fisher Scientific)으로 염색되었습니다., 밴드의 증가 농도에서는 일부분을 포함하는 강력한핵세포화학유인물 활동을 잘하게 하고 젤에 소화되기 전에 분석을 가진 Q Exactive HF 질량 분석계(Thermo Fisher Scientific). 질량 분석 데이터는 마스코트 검색 엔진과 함께 Swissprot 데이터베이스를 사용하여 분석되었습니다.
그의 태그 재조합 CCL21 및 binding assay
마우스 CCL21 코딩 시퀀스에서 증폭 C57BL/6 마우스 비장 및 cDNA 복제 사 NdeI 및 XhoI 사이트의 pET22b+expression vector(발현량)을 제공합 C 터미널이 그의 태그입니다., 재조합 단백질은 BL21(DE3)마우스에서 발현되고 그의 태그에 의해 정제되었다. 단백질 순도 및 농도는 각각 sds–PAGE 및 BCA 분석법에 의해 평가되었고,생체 활성은 칼슘 동원 분석법을 사용하여 검증되었다. 재조합 단백질은 사용할 때까지 -80°C 에서 저장되었다. Ccr7 을 양성 대조군으로 사용하여 GPR174 에 대한 CCL21-His 결합을 측정하기 위해 293T 세포를 GPR174–GFP 또는 CCR7–GFP 융합 구조로 형질 전환시켰다., 이어서 형질 전환 된 세포의 Aliquots 를 37℃에서 30 분 동안 지시 된 농도로 CCL21-His 단백질로 배양하고,차가운 PBS 로 2 회 세척하고,4%파라 포름 알데히드로 즉시 고정시켰다. PBS 에서 세척 한 후,고정 된 세포를 phycoerythrin-conjugated anti-His 항체(clone J095G46,Biolegend)로 염색하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다., GFP−세포에서 각 샘플을 제공으로 일반적인 배경 염색한 내부 통제하고,뜻 형광 강도(MFI)의 GFP+셀로 얼룩진 phycoerythrin-활용 방지-자신의체로,MFI 의 해당 GFP−세포는 차감 사용되었을 정량화하는 특정 CCL21 구속력이 있습니다.
케모카인-트리거된 칼슘 플럭스의 측정
마우스 Gpr174 및 Ccr7 을 PCR 에 의해 증폭시키고 pRK5 플라스미드로 클로닝하였다. HEK293T 세포를 gpr174-발현,CCR7-발현 또는 대조군 플라스미드로 과도 형질 전환시켰다., 세포를 transfection 후 배양 용기 48h 로부터 물리적으로 분리하고,PBS 로 2 회 세척하고,30 분 동안 37°C 에서 pbs 에서 1μm Indo-1(Invitrogen)로 염색 하였다. Pbs 로 두 번 세척 한 후,세포를 25mm Hepes 와 1%FBS 를 함유 한 Hanks 의 균형 잡힌 소금 용액(Invitrogen)으로 resuspended 하고 얼음 위에 유지시켰다. 을받을 때 chemokine 자극,셀 처음으로 물 배치 37°C 에서 5 분 동안의 배양한 다음에 평가하는 LSR II cytometer(BD 생명 과학)을 설정하는 기준에 대한 unstimulated 상태입니다., 세포를 0.1ng ml−1 내지 10μg ml−1 범위의 재조합 CCL21 의 농도 계열로 자극 하였다. 각 조건의 세포를 2 분 동안 지속적으로 모니터링하고 기록 하였다. 말기에,이오노마이신(Sigma)을 1μg ml−1 의 최종 농도로 시료에 추가로 첨가하고,시료를 추가로 모니터링하고 1 분 동안 기록 하였다. Flowjo(TreeStar)에서 분석 한 바와 같이 Indo-1(bound)/Indo-1(free)비율은 세포 내 Ca2+농도를 나타 내기 위해 사용되었습니다. 이오노 마이신에 의해 자극 된 가장 높은 Ca2+농도는 CCL21 에 의해 유도 된 칼슘 반응을 정상화하기 위해 100%로 사용되었다., EC50 은 GraphPad 에서 3 매개 변수,비선형 용량-응답 곡선을 피팅하여 추정되었습니다.
Immunoprecipitation 및 서 압
갓 고립 된 마우스 B 세포에서 GPR174GFP BAC 유전자 변형 쥐가 활성화되었으로 10µg ml−1F(ab)2goat anti-mouse IgM10µg ml−1anti-CD40 48h. 이러한 활성화된 B 세포는 그 후에 일시 중단 2×107 당 셀 millilitre 에는 경우를 포함하는 1%FBS,그리고 치료 또는 자극 300ng ml−1CCL21 37°C30min. 이어서 B 세포를 1%NP-40 용해 완충액(25mM Tris-HCl,ph7.,4,137mM NaCl,1%Nonidet P-40,20%글리세롤 및 프로테아제 억제제). GFP-태그 된 GPR174 의 면역 침착을 위해,108 개의 B 세포의 용해물을 20μl 의 GFP–트랩 비드(ChromoTek)로 밤새 배양 하였다. 반복 세척 후,immunoprecipitates 를 실온에서 10 분 동안 0.2M 글리신 완충액(ph3.0)에서 배양하여 용출 한 다음 1M Tris-HCl(pH8.5)으로 중화시켰다. 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리하고 폴리 비닐 리덴 막(Millipore)으로 옮겼다. 멤브레인은 5%BSA 및 0.1%Tween20 을 함유하는 트리스 완충 식염수로 차단되었다., 을 감지하는 대상을 분자 immunoblotting,우리가 사용되는 토끼 anti-GFP(Abcam),토끼 anti-가-1(Abcam),토끼 anti-가-2(Abcam)토끼 anti-Ga13(Abcam)체입니다. HRP-conjugated goat anti-rabbit 항체는 Bioeasytech 에서 구입했습니다. 면역 블롯은 강화 된 화학 발광(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 검출되었고,이미지는 ImageJ 소프트웨어로 분석되었다.
정량 PCR
원하는 유형의 세포를 FACSAria III 로 분류하고 제조업체의 지침에 따라 RNeasy Plus Mini 또는 Micro kit(Qiagen)로 총 RNA 추출을 실시했습니다., Rna 는 올인원 RT MasterMix(Abm)로 역전사되었다. 정량적 PCR 은 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 qPCR MasterMix(Abm)로 수행되었습니다., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., 상이한 샘플 중 표적 유전자의 상대적 발현은 하우스 키핑 유전자 Actb 또는 Gapdh 의 발현에 대한 정규화 후에 비교되었다.
통계 데이터 분석
통계 및 그래프는 Prism(Graphpad)에서 수행되었습니다. 달리 명시되지 않는 한,두 꼬리 짝이없는 학생의 t-테스트는 다른 그룹의 끝점 수단을 비교하는 데 사용되었습니다.
보고 요약
에 대한 자세한 정보는 연구 디자인에 자연의 연구 보고 요약 연결되어 이 문서에서는 다루지 않겠습니다.피>