우리는 최근에 사용되는 CRISPR 을 방해하는 Kras oncogene 에서 두 개의 독립적인 폐 선 암 세포 라인에서 파생되었습니다 Kras G12D;p53fl/fl(KP)mice. 우리는 엑손 2 에서 각각 프레임 시프트 삭제를 운반하는 두 개의 단일 세포 클론을 분리했다(그림 2)., 1a 및 추가 파일 1:그림 S1a):KP1 은 g12d 대립 유전자에서 2-nt”-CG”삭제 및 그렇지 않은 야생형(WT)Kras 대립 유전자에서 1-nt”-C”삭제를 전달하며,KP2 는 2-nt”-GG”삭제를 전달합니다. 어느 복제 생산하는 전체 길이 Kras 단백질을 나타내는 세 가지 모두 삭제해 Kras 읽는 프레임입니다.
sgRNA 타겟팅 Kras 유도 exon skipping 에서 단일 세포 클론. 마우스 Kras 유전자(sgKras)의 엑손 2 를 표적으로하는 sgRNA 의 도식., 빨간색 화살촉은 Cas9 분열 부위를 나타냅니다. KP1 및 KP2 세포주를 Cas9 및 sgKras 를 암호화하는 렌티 바이러스로 형질 전환시켰다. 두 개의 단일 셀 클론(KP1 클론 및 KP2 클론)은 프레임 시프트 삭제를 수행합니다. 검은 색 화살표는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)프라이머의 위치를 나타냅니다. G12D 코돈은 밑줄이 그어져 있습니다. B Kp 부모 세포(파란색)및 KP 클론(빨간색)의 RNA-sequencing(RNA-seq)분석에서 정규화 된 Kras 판독 횟수. RNA-seq 는 KP2 클론에 대해 두 번,다른 그룹에 대해 세 번 수행되었습니다. “+”는 WT 대립 유전자를 나타낸다., 부분 엑손을 보여주는 c RNA-seq2kp1 클론에서 건너 뛰기. RNA-seq 번호는 표시된 엑손 접합에 걸친 읽기를 나타냅니다. 두 가지 대표적인 생물학적 복제가 표시됩니다. Kras mRNA 의 d RT-PCR 분석은 엑손 2 스킵 밴드를 검출한다. 예상된 밴드 크기는 331bp 및 209bp. M,분자 마커. “*”는 클론의 PCR 제품에서 indels 를 나타냅니다. kp1 및 KP2 클론 모두에서 변경되는 22 개의 엑손 이벤트를 보여주는 e 산포도. Kras exon2 의 배제는 가장 빈번한 이벤트입니다., Ψ,백분율 접합 Index
Frameshift 돌연변이 초기에 exons 을 유발하는 것으로 알려진 말도-mediated decay(NMD),which eliminates mRNAs 조기 종료 codons. 때 우리는 분석 mRNA 시퀀싱(RNA-seq)데이터를,그러나,우리는 명백한 Kras mRNA 준(예:총 정규화 mRNA 읽어)만큼 감소 19%에 KP1 세포에서 47%KP2 세포에 비해,부모의 KP 세포(Fig. 1b). 두 클론 모두 엑손 2 읽기는 적지 만 정상 수준의 엑손 1 과 3 읽기는 생성되었다(그림 1)., 1c),엑손 2 가 KP1 및 KP2 클론에서 건너 뛸 수 있음을 시사한다. 실제로,우리는 엑손 1-3 접합 읽기를 감지하여 엑손 2 가 건너 뛰었 음을 나타냅니다(그림 1). 1c 및 추가 파일 1:그림 S1b). 계산 사이의 비율 exon2 읽기 및 총 읽고,우리가 발견 exon2 포함되어 있에서만 64.0±9.1%의 Kras 에서 읽고 KP1-에 복제(Fig. 1c 및 표 1). Kp2-클론에서 유사한 엑손 2 건너 뛰기가 관찰되었다(추가 파일 1:그림 S1c)., Concordantly,역사의 Kras mRNA 다음 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)나왔고 두 제품은:중 하나에 맞 그대로 Kras 보완 DNA(cDNA)및 다른 맞 exon1-3isoform(Fig. 1d). Exon1-3isoform 유지 부분 Kras 열어 읽기 프레임을 시작할 수 있는 번역에서는 ATG codon 에 exon3(추가 파일 1:그림 S2)를 생산하고 심각하게 잘립니다 Kras 단백질이다.,
편집 Kras 을 유도 하지 않았 대체 접합 genome-wide. 우리는 kp1 세포에서 97 개의 대안 적으로 접합 된 엑손과 KP2 세포에서 177 개의 이벤트를 확인했다. KP1 및 KP2 클론 공유 22 카세트를 포함 또는 제외 이벤트를 제외한 Kras exon2 되는 것이 가장 큰 변화는 모두에 복제(Fig. 1e 및 추가 파일 1:표 S3). 따라서,Kras 엑손 2 의 편집은 특별히 Kras 엑손 2 의 건너 뛰기를 유도했다., 특히,반면 마우스 Kras G12D(GGU 을 GAU)성적증명서 생략하지 않 exon2 부모의 KP 셀,우리가 발견~15%의 인 KRAS G12S(codon12GGU 을 AGU)성적표를 건너뛰 exon2A549 인간의 폐암 세포 라인(추가 파일 1:그림 S1d). 우리는 할 수 없습을 예측하는 손익의 exon 결합 강화하거나 소음기,데이터는 것이 좋습니다 하지만 우리의 순서대로 나열하는 근 Kras codon12 촉진 exon2 포함에서 마우스 인 Kras. CRISPR 편집에 의해 유도 된 엑손 건너 뛰기는 Kras 또는 마우스 KP 세포에 국한되지 않았다., 최근의 연구에 따르면 HeLa 세포에서 FLOT1 엑손 3 의 CRISPR 편집은 엑손 3,엑손 4 또는 엑손 3,4 및 5 의 건너 뛰기를 유발할 수 있습니다. 우리는 또한 인간 HCT116 세포에서 lmna 의 엑손 11 을 표적으로 삼을 때 드문 엑손 건너 뛰기를 검출했다(추가 파일 1:그림 S3). Lmna exon11 을 건너 뛰면 신형 단백질로 번역 될 수있는 프레임 내 성적표가 생성됩니다.
더 아이디어를 탐구하는 exon 건너뛰기를 생산할 수 있는 기능성에 프레임 성적증명서,우리는지 여부를 묻는 CRISPR 중재의 편집 Ctnnb1exon3 를 일으킬 수 있는 exon skipping 원인과 이득의 기능 phenotype., Exon3 의 Ctnnb1 인코딩합 phosphoacceptor 잔류물 분해를 촉진하의 β-Catenin transcription factor;유전 절제의 Ctnnb1exon3—에 있는 프레임 exon4—안정화 constitutively active β-Catenin 축적하는에서 핵. 우리는 설계 11sgRNAs 는 대상 영역이 따라 Ctnnb1exon3(Ctnnb1-sg1 을 sg11 사),불리고 개별 sgRNAs 로 KP 세포 및 사용되는 고 처리량 시퀀싱 분석의 범위에 편집 sgRNA 대상 사이트에서 각 라인(Fig. 2b x 축,추가 파일 1:그림 S4 및 추가 파일 2:표 S4)., 3 개의 sgRNAs(sg6,sg9 및 sg10)는 비효율적으로 Ctnnb1 을 표적으로 삼았다. 그러나 Ctnnb1sgRNAs 중 8 개(sg1~sg5,sg7,sg8 및 sg11)는 20%를 초과하는 주파수로 목표 부위에서 indels 를 유도했습니다. 예를 들어,Ctnnb1-sg1 은 읽기의 약 65%에서+T 삽입을 생성했습니다(그림 1). 2 기음). 강한 Ctnnb1sgRNA 에 의해 표적화 된 각 인구에서,우리는 엑손 2 내지 5 에 걸쳐있는 3 개의 RT-PCR 생성물을 검출 하였다(그림 1). 2d). 주요 제품은 엑손 3 을 포함하는 정상적으로 접합 된 성적표에 해당합니다. 다른 두 제품은 대안 적으로 접합 된 성적표에 해당합니다:엑손 3 을 건너 뛰는 것(즉,, 엑손 2-4 접합,그림. 2e)및 엑손 3 및 4 모두를 건너뛰는 것(즉,엑손 2-5 접합,도 1). 2 층). DNA 가닥 유도 엑손 건너 뛰기 및 Cas9 뉴 클레아 제 활성 중 하나를 표적으로하는 Ctnnb1sgRNAs 는 엑손 건너 뛰기에 필수적이었다(도 1). 3a).
ctnnb1 엑손 3 을 표적으로하는 sgRNAs 는 엑손 건너 뛰기를 유도한다. Ctnnb1 유전자의 도식. 인-프레임 엑손 3 은 억제 도메인을 코딩한다:인산화 아미노산 33,37,41,45 는 β-카테닌 단백질의 분해를 촉진한다., 엑손 3 의 손실은 β-카테닌을 안정화시킨다. 11 개의 sgRNAs 는 각각 엑손 3:붉은 색의 강한 sgRNAs 와 검은 색의 약한 sgRNAs 를 표적으로하도록 설계되었습니다. “NGG”PAM 을 사용하는 sgRNAs 는 exon3 위에 표시되고”CCN”PAM 을 사용하는 sgRNAs 는 exon3 아래에 표시됩니다. b 엑손 3 건너 뛰기와 sgRNA 효율 사이의 상관 관계. 게놈 인델은 깊은 시퀀싱으로 측정되었습니다. KP 세포는 렌티 바이러스에 감염되었다. Exon3 건너 뛰는 효율성은(d)에서 비롯됩니다. Sg11 의 Indels 는 결정되지 않았습니다. >20%indels 를 유도하는 sgRNAs 는 빨간색으로 표시됩니다., sg1indels 의 c 분포는 엑손 3(적색 화살촉)의 Cas9 분열 부위 뉴클레오티드 97 에서의 T 삽입(+T)이 가장 빈번하다는 것을 보여준다. 팸 시퀀스는 파란색입니다. 엑손 2 및 5 에 걸친 프라이머를 사용하는 d RT-PCR 은 부분 엑손 건너 뛰기를 나타낸다. M 분자 마커. sgGFP 는 컨트롤 sgRNA 입니다. Exon3 건너 뛰는 밴드를 ImageQuant TL 소프트웨어를 사용하여 정량화하고 전체 길이의 cDNA 밴드로 정규화 하였다. sg4 는 정량화 할 수없는 가시적 인 약한 밴드를 보였다., e,f TOPO 클로닝 및 Sanger 시퀀싱은(c)에서 두 개의 주요 하부 RT-PCR 밴드가 각각 엑손 2-4 및 엑손 2-5 의 대안적인 스 플라이 싱임을 확인했다. β-카테닌의 G 웨스턴 블롯 분석. 전체 길이 β-Catenin 은~86kD 입니다. 엑손 3 이없는 β-카테닌(델타 엑손 3)은~77kDa 이다. Actin 은 로딩 제어
Cas9nuclease 활동 건너뛰는 데 필요한 하나 이상의 exons., RT-PCR 분석을 Ctnnb1mRNA KP 세포 불리고 lentiviruses 인코딩하는 sgCtnnb1.2nuclease 결함 Cas9(dCas9),dCas9-리아 퓨전,WT Cas9. Rt-PCR 은 퓨로 마이신 선택 및 FACS 정렬 후 형질 전환 된 KP 세포 집단에서 엑손 2 및 7 의 프라이머를 사용하여 수행되었다. 엑손 길이 및 판독 프레임 단계가 도시된다. 엑손 2-4 스플 라이스 생성물 만이 프레임 내 β-카테닌 코딩 서열을 유지한다. Cas9 및 sgGFP,sg3 또는 sg5 를 암호화하는 렌티 바이러스로 형질 전환 된 KP 세포에서 Ctnnb1mRNA 의 b RT-PCR 분석., “–”,치료되지 않
웨스턴 오 분석으로는 세포는 인구로 불리고 강력한 sgRNAs 생산 작~74kD β-Catenin 단백질에 해당되는 크기에서 예상되는 것에서 exon2-4 결합품(Fig. 2 그램). 전체 길이 β-카테닌 단백질은 형질 전환 4 일 후 유의하게 고갈되지 않았다. 는지 여부를 테스트하는 대체 접합에 따라 지속적인 표현의 Cas9 또는 sgRNA 에 lentiviral vector,we co-transfected Cas9 및 Ctnnb1-sg1 또는 타겟팅 sgRNA 제어합니다., Transfection7 일 후,transfected Cas9 와 guide Rna 가 고갈되어야 할 때,우리는 면역 형광에 의한 β-카테닌 국소화를 조사했다. 에서 마우스를 섬유 아세포와 페 비 대상 제어 sgRNA,β-Catenin 지역화된 세포 junction(추가 파일 1:그림 S5a). 대조적으로,Ctnnb1-sg1 로 형질 전환 된 많은 세포에서 우리는 핵에서 β-카테닌을 검출했다(추가 파일 1:그림 S5a)., 이러한 결과는 지속적인 편집가 필요하지 않습 exon 건너뛰고 exon3 건너뛰기에 의해 유도 된 CRISPR 중재의 편집 Ctnnb1exon3 의 이익을 생성하의 기능 β-Catenin isoform.
우리는 Ctnnb1-sg2,-sg3 및-sg5 로 처리 된 세포 집단에서 엑손 2 내지 7 에 걸친 성적표를 추가로 분석했다. 또한 전체 길이 isoform,우리는 검출 된 네 개의 성적 증명서와 함께 exon2 분명히 접합을 각각 다운스트림 exon(즉,exon2-4,exon2-5,exon2-6 및 exon2-7;Fig. 3a,b)., 우리가 이해하지 못하는 메커니즘의 이 무차별이 분명히 exon skipping 에 의해 유도 된 Ctnnb1exon3 편집,도 우리는 할 수 있었다 상관 관계를 무차별 exon skipping 보시려 대상 사이트 또는 indel 돌연변이에서 엑손 3. 그럼에도 불구하고 우리는 잠재적 인 메커니즘을 제안하는 Ctnnb1-sg3 편집 클론을 분리했습니다(추가 파일 1:그림 S6a). 이 biallelic 복제를 포함한 3bp 에서-프레임을 삭제 하나의 대립과 큰 832-bp 삭제에서 다른 832-bp 삭제 퓨즈 5’end of intron2 3’end of exon4(추가 파일 1:그림 S6)., 우리가지 성적증명서에 이러한 셀:적절하게 접합된 성적증명서 포함되는 3-bp 삭제 내용을 포함하는 intron2 융합 exon4(추가 파일 1:그림 S6c 및 표 1). 이러한 결과는 명백한 exon 건너뛰기에 감지 인구의 편집 셀 수 있는 게놈 반영 재배열 제거하는 exons.
두 가지 실험은 단일 sgRNA 가 엑손을 제거하는 큰 게놈 삭제를 유도 할 수 있다는 생각을 뒷받침합니다., 예를 들어,우리는 절연 15 클론에서 마우스 3T3cells 일시적으 페 Cas9 및 Ctnnb1-sg1 하고,네 개의 복제(즉,클론 4,5,13,15)보여 명백한 exon skipping 에 의한 RT-PCR. 게놈 PCR 공개 게놈 재배열에서 세 이러한 클론의 큰 삭제(>500bp)고 작은 삭제(~100bp)에서 복제 4 15,대형 삽입에 복제 13 과 15(추가 파일 1:그림 S7)., 또한,대상으로 후 exon6 의 p65/휴식,우리는 절연 biallelic p65 복제(#15):하나의 대립에 항구 1nt”+A”삽입하고 다른 항구 2268-bp 삭제를 제거하는 exons5,6,7(추가 파일 1:그림 S8a,c–e). P65 클론#15 에서,우리는 완전히 접합 된 성적표와 엑손 4-8 스플 라이스 생성물을 검출했다(추가 파일 1:그림 S8c). 모두 대립 인코딩 frameshifted 성적 증명서 및 모두 p65 성적 증명서는 현재 낮은 수준에서 보다 무게(파일을 추가 1:그림 S8b)., 우리는 또한 절연 편집 p65 복제(#31)homozygous 에 대한 동의 삽입에 복제#15,그러나 복제#31 하지 않을 생산 또는 접합된 합니다. 따라서,클론#15 에서 엑손 4-8 스플 라이스 된 성적표는 엑손 5,6,7 의 삭제로 인한 결과이다. 이러한 대규모 엑손 삭제 이벤트는 예상치 못했고 일반적인 PCR 기반 스크리닝 분석법을 사용하여 놓칠 수 있습니다.,
일으킬 수있는 능력을 증가 함수는 활동에 의해 유도 exon skipping 또는 exon 절단이 제안하는 CRISPR 묵상을 편집하여 단일 sgRNA 수 있는 유용한 방법으로 부분적으로 구조를 기능을하는 질병 유전자 요구하는 낮은 수준의 구조입니다. CRISPR 중재 동종 DNA 복구하는 데 사용되었습 올바른 조 정지 codon 돌연변이 Dmd 유전자의 마우스 모델에서 DMD 고 여러 그룹에서 사용되는 CRISPR 삭제 Dmd exons 부분적으로 복원 Dmd 표현이다. 우리는 Dmd 유전자의 엑손 23 에서 다른 부위를 표적으로하는 4 개의 sgRNA/Cas9 렌티 바이러스를 설계했다(도 1)., 4a,b)및 형질 전환 마우스 C2C12myoblasts,DUCHENNE 근이영양증(DMD)의 모델로 널리 사용되는 세포주. Dmd sgRNAs 로 형질 전환 된 C2C12 세포에서 우리는 엑손 23 을 함유 한 정상적인 스플 라이스 생성물에 해당하는 RT-PCR 생성물을 검출했다. 는 시퀀싱 이러한 RT-PCR 제품을 공개만 Dmd-sg2 효율적으로 편집 Dmd exon23 에 의해 입증된 혼합 시퀀스의 봉우리를 넘어 sgRNA 대상 사이트에(파일을 추가 1:그림 S9). Dmd-sg2 로 형질 전환 된 세포에서,우리는 또한 엑손 24 에 접합 된 엑손 22 에 상응하는 RT-PCR 생성물을 검출 하였다(도 2). 4c,디)., 따라서 타겟팅 exon23 하나 sgRNA 하는 것으로 충분할 수 있습을 유도하는 부분 exon 건너뛰기 생산하고 있는 그대로 디스트로핀 오픈 프레임을 읽. DMD 는 소량의 기능 회복이 실질적인 임상 적 이익을 제공 할 수있는 질병의 고전적인 예입니다.
Dmd 의 엑손 23 을 표적으로하는 sgRNA 는 프레임 내 디스트로핀 mRNA 를 부분적으로 회복시킬 수있다. 마우스 Dmd 엑손 23 의 sgrna 표적화 및 건너 뛰기의 개략도 및 RT-PCR 분석을위한 프라이머의 위치., 엑손 23 의 건너 뛰기는 프레임 내 mRNA 를 생성합니다. dmd 엑손에서 b sgRNA 대상 사이트 23. Cas9 및 sgDmd1,2,3 또는 4 를 암호화하는 렌티 바이러스로 형질 전환 된 c2c12 마우스 myoblast 세포의 c RT-PCR 분석. 예상된 밴드 크기는 353bp 및 140bp. M 분자 마커. sgDmd2 처리 된 세포로부터의 140-bp cDNA 밴드의 d 서열 분석은 엑손 22 에서 엑손 24