Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174-mangelfull mus ble generert av standard gen-målretting prosedyrer for å erstatte Gpr174 open reading frame med en LacZ/neo kassett med 129SvEvBrd embryonale stamcellene linje (Texas A&M Institute for Genomisk Medisin, TG0128). Disse GPR174-mangelfull mus ble backcrossed å C57BL/6-mus for 12 generasjoner. Relevante mus på C57BL/6 bakgrunnen var interbred å få GFP-å uttrykke MD4 mus og dsRed-å uttrykke GPR174-tilstrekkelig eller -mangelfull MD4 mus., Alder-matchet littermates mellom 6 og 12 ukers alder og er indikert kjønn ble brukt til eksperimenter. Eksempel størrelser for mus eksperimenter ble empirisk bestemt, og mus ble randomisert til kontroll eller eksperimentelle gruppen. Ingen blinding var nødvendig for musen eksperimenter som presenteres her. Alle mus ble opprettholdt under bestemte-patogen-gratis betingelser og ble brukt i samsvar med statlige og Tsinghua Institutional Animal Care and Use Komiteen retningslinjer for dyrevelferd.,
GPR174–GFP BAC transgene mus
Sekvenser koding for glysin–glycine–glycine–serin (GGGS) linker (gjentatt fire ganger) og forbedret GFP (EGFP) ble satt inn umiddelbart før den stopper codon av GPR174 open reading frame i musen BAC klone RP23-206J14 av homologe rekombinasjon. Den modifiserte BAC ble renset og microinjected i pronuclei av befruktede egg for å generere transgene journalister. En grunnlegger mus som ble vist positiv for GFP-å uttrykke B-celler i blodet ble brukt til å avle videre med B6 mus for å etablere GPR174–GFP BAC belastning.,
Celle kultur, retrovirus og in vitro transduksjon
Naive T-celler eller B-celler ble isolert ved hjelp av den Negative CD4 T-celler Isolert sett eller Naive B-celler Isolert Sett (Miltenyi Biotec) i henhold til produsentens protokoller. For å overexpress mål gener i B-celler, renset B-celler ble aktivert med 1 µg ml−1 lipopolysaccharide (Sigma) for 1 dag før spin-infisert med retroviral supernatants på 1,500 g for 2 h, som described18.
Bygging av benmarg chimaeras
B6 mottaker mus ble livsfarlige bestrålt av X-ray (5.,5 Gy to ganger) og deretter gitt en intravenøs overføring av 3 × 106 sex-matchet benmarg celler, som består av 80% µMT celler og 20% GPR174-tilstrekkelig eller -defekte celler. Chimaeras ble brukt til eksperimenter seks til åtte uker etter rekonstituering.
Gonadectomy
Mus etter avvenning var anaesthetized med avertin (2.5%, 0.015 ml g−1 kroppsvekt) intraperitoneally. For ovariectomy av kvinnelige mus, eggstokkene på begge sider ble utsatt og fjernet gjennom bilaterale dorsal snitt., For orchidectomy i male-mus, en median abdominal snitt ble gjort for å avdekke og fjerne testiklene på begge sider. Humbug-opererte kontroll mus gjennomgikk kirurgi inkludert bilaterale dorsal snitt eller en median abdominal snitt uten fjerning av eggstokkene eller testiklene. Kirurgiske sår åpninger ble sutureres, og antibiotika og analgetika ble brukt lokalt. Musene fikk lov til å gjenopprette for åtte uker før påfølgende eksperimenter.,
Testosteron behandling
Seks til åtte uker gamle mus ble injisert subkutant med testosteron (10 mg kg−1 kroppsvekt) oppløst i sunflower seed olje annenhver dag i to uker. Kjøretøy kontroll mus som ble behandlet med sunflower seed olje alene.
Anledning transfer, immunisering og viral infeksjon
for Å måle germinal-sentrum dannelse av MD4 B-celler, 105 OT-II T-celler og 5 × 105 MD4 B-celler av angitt genotypes var intravenøst overført til mannlige B6 mottakere, som senere ble vaksinert subkutant med 0.,5 µg lipopolysaccharide og 30 µg HEL–OVA-antigen-konjugat i alun (Thermo Scientific). Den HEL–OVA var laget av kjemiske crosslinking med en HydraLink konjugasjon kit (SoluLink) som tidligere described19. For å måle germinal-sentrum-formasjonen i respons til SRBC immunisering eller lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) infeksjon, mus ble injisert intraperitoneally med 5 × 108 SRBCs (fra Z. Baiji) eller 2 × 105 plakk-forming enheter av LCMV Armstrong virus (fra L. Dere og R. Ahmed).,
EAE av MOG protein immunisering
sekvensen koding første 120 aminosyrer av menneskelig MOG ble forsterket av polymerase kjedereaksjon (PCR) fra en menneskelig hjerne komplementære DNA-bibliotek, og klonet mellom NdeI og XhoI områder av pET22b+ uttrykk vektor (Novagen). Menneskelige MOG protein ble uttrykt i BL21(DE3) Escherichia coli og renset ved sin carboxy-terminal histidin (Sin) – tag. Protein renhet og konsentrasjon ble vurdert ved SDS–PAGE og bicinchoninic syre (BCA) protein analyse, henholdsvis. Rekombinante proteiner ble lagret ved -80 °C, inntil de skal brukes., For å indusere EAE, benmarg-chimeric dyr indikert typer ble vaksinert subkutant på flanken med 200 µg rekombinant human MOG protein emulsified i komplett Freund er adjuvant på dag 0. Mus ble injisert intravenøst med 200 ng av kikhoste toksin (Invitrogen) på dag 0 og 2. Mus ble overvåket daglig i en blind måte for progresjon av sykdommen, fra dag 1. Sykdommens alvorlighetsgrad ble scoret som følgende: 0, ingen kliniske tegn; 1, lammet hale, 2, tap av koordinert bevegelse og pareser av bakbeina lemmer; 2.5, lammelse av ett bakbein; 3, lammelse av begge bakbeina lemmer; 3.,5, lammelse av begge bakbeina lemmer og svakhet i forelimbs; 4, lammelse av forelimbs; og 5, døende. Å sammenligne sykdommens alvorlighetsgrad, studerte vi ti mus per betingelse per eksperiment, og analysert sykdom score over tid med to-veis ANOVA.
flowcytometri
Måling av antigen-spesifikke antistoff titre
for Å måle SRBC-spesifikke antistoffer titre, vi lysert 5 × 108 SRBCs med 1 ml dobbel-destillert vann og sentrifugerte dem på 15,000 r.s.m. etter 20 min., Den pellet ble resuspendert i PBS og brukes til å belegge MaxiSorp enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plater (Nunc Maxisorp) over natten ved 4 °C. for Å måle MOG-spesifikke antistoffer, vi brukte 2 µg ml−1 renset rekombinant human MOG å belegge ELISA-plater. Uspesifikk binding ble blokkert med 1% bovint serum albumin (BSA) i PBS med Tween-20 (PBST) for 2 h ved 37 °C, etterfulgt av inkubasjon med 2× serielle fortynninger av serumprøver av vaksineres mus for 1 time ved 37 °C., Platene ble vasket og inkubert med pepperrot peroksidase (HRP)-conjugated anti-mus IgG sekundært antistoff (1/20,000) for 1 time ved 37 °C. Platene var vasket, utviklet med 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) og sluttet med 1 M HCl. Vi setter tomme brønner som null, og tatt opp absorbans ved 450 nm. Vi brukte sera fra unimmunized mus som negativ kontroll; cut-off-verdien var optisk densitet ved 450 nm (OD450) av den negative kontrollen multiplisert med 2.1. Et godt sammen med en OD450 verdien av ikke mindre enn cut-off-verdi ble ansett som positive., Den høyeste fortynning av en prøve som ga positivitet er titre av prøven.
Distribusjon av B-celler ved immunohistochemistry
For ulike eksperimenter, naive B-celler, B-celler aktiveres for 1 h med 10 µg ml−1 F(ab’)2 geit anti-mus IgM (Jackson Immunoresearch), eller B-celler transduced med retrovirus ble overført til B6 mottakere. Når det er nødvendig, disse cellene ble merket med 1 µM tetramethylrhodamine (TAMRA), 4-chloromethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin (CMF2HC) eller 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) (Invitrogen)., Spleens eller inguinal lymfeknuter på mottakeren mus ble løst med 1% paraformaldehyde for 12 h, og deretter dehydrert i 30% sukrose løsning for 12 t ved 4 °C. for Å sikre maksimal representasjon av ulike organ regioner i det endelige datasettet, vi behandlet nonconsecutive vevsprøver og farget dem med angitt antistoffer. Farging reagenser inkludert eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), kanin anti-GFP (abcam), og AF488 geit anti-kanin IgG (Invitrogen)., Lysbilder ble montert med ProlongGold Antifade reagens (Invitrogen) og undersøkes med en Olympus FV1000 oppreist mikroskop. Bildene ble analysert med Imaris (Bitplane) og ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
Splenic stroma forberedelse
Spleens fra mus, rotter og griser ble gjentatte ganger presset og bakken mot et metallnett å slippe røde blodlegemer og lymfocytter. De resterende unsuspendable, amorphic stromal vev elementer ble grundig vasket med PBS før de blir plassert i B27 serum-fri kultur medium (Invitrogen) og inkubert ved 37 °C i 12 h., For mus, stromal elementer fra tre dyr ble dyrket i 1 ml medium. For griser, stromal elementer fra 1 milt ble dyrket i 80 ml. Den resulterende kultur var sentrifugerte på 10.000 r.s.m. for 60 min for å få den har medium, som var enten umiddelbart brukes til eksperimenter eller frosset ved -20 °C før bruk.
Transwell analysen
B-celler aktiveres med 1 µg ml−1 lipopolysaccharide for 60 h ble brukt for å analysere ulike fraksjoner som følge av biokjemiske fractionation., Naive B-celler eller B-celler aktiveres med 10 µg ml−1 F(ab’)2 geit anti-mus IgM (Jackson Immunoresearch) og 10 µg ml−1 anti-CD40 (klone FGK4.5, Bio X Celle) ble brukt til analysen CCL21-indusert migrasjon. Når B-celler av ulike genotypes ble sammenlignet, minst tre donor mus av hvert genotype og behandling ble brukt til å isolere B-celler i hvert eksperiment, og littermates var alltid brukes. B-celler ble suspendert på 106 celler per milliliter og uthvilt i RPMI medium som inneholder 1% FBS ved 37 °C i 1 time., Ved siden av en total av 100 µl cellesuspensjon ble lagt til det øvre kammeret i en 5-µm-pore Transwell (Corning Costar), og en total av 150 µl tiltrekkende-som inneholder løsninger ble lagt inn i nedre kammer. Disse løsningene inkludert kultur medium rom med råolje musen splenic stroma forberedelse, kultur medium rom med rå svin splenic stroma forberedelse, elution fraksjoner fra kromatografi, kultur medium som inneholder rekombinant CCL21 og CCL19 (Peprotech), eller 18/0 LysoPS (Avanti Polare Lipider) i angitt konsentrasjoner., For noen eksperimenter, murin stroma-kondisjonert medium først ble supplert med en sluttkonsentrasjon på 5 µg ml−1 nøytraliserende antistoffer mot mus CCL21 eller CCL19 (R&D system) eller geit IgG isotype kontroll, og inkubert ved 4 °C i 3 timer før den blir brukt til transwell analysen. Antistoffet dose var minst er tilstrekkelig til å nøytralisere 100 ng ml−1 CCL21 eller CCL19, som fastsatt i innledende eksperimenter. Cellene fikk lov til å transmigrate for 3 timer ved 37 °C i en inkubator., Celler som hadde migrert til bunnen brønner ble nevnt av flowcytometri, med fluorescerende A20 celler av kjente tall lagt til umiddelbart før lesing som en intern opptelling standard. Hver tilstand ble målt i triplikat brønner, med mindre annet er angitt.
Biokjemiske fractionation
Kromatografi ble utført ved hjelp av et ÄKTApurifer 10 fast protein væske-kromatografi (FPLC) system (GE Healthcare) ved 4 °C, med unntak av det siste trinnet, som ble utført ved hjelp av et ÄKTAmicro FPLC system (GE Healthcare)., En sum på 1 200 ml svin stroma-kondisjonert medium ble brukt til en anion-exchange-kolonnen (250 ml bed volum) likevekt med buffer I (25 mM Hepes, pH 7.0). Kolonnen ble vasket med tre kolonne-volumer før de blir eluted med tre kolonne-volumer av buffer-jeg supplert med 1 M NaCl. Flyten gjennom var buffer-endret med buffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8.5) i 100 ml og kommer tilbake til et anion-exchange-kolonnen likevekt med buffer II. Kolonnen ble vasket med to kolonner volumer av buffer II og eluted med to kolonner volumer av et 0,1–0,5 M lineær NaCl gradient., Fraksjoner av 10 ml hvert ble samlet inn, og delprøver var buffer-endret med RPMI 1640 for transwell analysen. Aktive fraksjoner ble sammenslått og buffer-endret til 10 ml med buffer II og lagt på en heparin kolonne (5 ml bed volum) likevekt med buffer II. Kolonnen ble vasket med 12 kolonnen volumer av buffer II og eluted med 4 kolonne mengder 0-2 M lineær NaCl gradient. Fraksjoner av 2 ml hvert ble samlet inn og delprøver var buffer-endret med RPMI 1640 for transwell analysen. Aktive fraksjoner var igjen samlet, buffer-endret til 0.,5 ml buffer jeg og lastet på Superdex-75 kolonne (24 ml bed volum) likevekt med buffer I. kolonnen ble deretter eluted med én kolonne volum av buffer I. Fraksjoner av 0,5 ml hvert ble samlet inn, og delprøver var buffer-endret med RPMI 1640 for transwell analysen. Aktive fraksjoner ble samlet og konsentrert i 0,5 ml til å laste ned en Mono S kolonne (1 ml bed volum) likevekt med buffer I. kolonnen ble vasket med 12 kolonnen volumer av buffer jeg og eluted med 25 kolonne mengder 0-0.5 M lineær NaCl gradient., Fraksjoner av 1 ml hver ble samlet inn, og delprøver var buffer-endret med RPMI 1640 for transwell analysen. Aktive fraksjoner ble sammenslått, buffer-endret og konsentrert i 50 ĩl med buffer jeg, og lastet på Mono S kolonne likevekt med buffer I. kolonnen ble vasket med tre kolonne-volumer av buffer jeg som inneholder 0,3 M NaCl, og eluted med 24-kolonnen volum på 0,3–0,4 M lineær NaCl gradient., Fraksjoner av 1 ml hver ble samlet inn, og delprøver var buffer-endret med RPMI 1640 for den endelige transwell analysen for å identifisere brøkdel som inneholdt den sterkeste chemoattractant aktivitet.
Mass spectrometry analyse
Fraksjoner fra den siste rensing trinn var konsentrert til 50 µl og analysert på 12% NuPAGE gur (Invitrogen). Gels ble farget med Pierce sølv flekken for mass spectrometry (Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens protokollen., Band av økt intensitet i fraksjon som inneholder de sterkeste chemoattractant aktivitet var excised og utsettes for i-gel fordøyelsen før de blir analysert med en Q Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Mass spectrometry data ble analysert ved hjelp av Swissprot database med MASKOTEN søkemotor.
Hans-merket rekombinant CCL21 og bindende analysen
musen CCL21 kodende sekvensen ble forsterket fra C57BL/6 musen milt cDNA og klonet mellom NdeI og XhoI områder av pET22b+ uttrykk vektor (Novagen), som gir en C-terminal Hans tag., Den rekombinant protein ble uttrykt i BL21(DE3) mus og renset ved sin Sin tag. Protein renhet og konsentrasjon ble vurdert ved SDS–PAGE og BCA analysen, henholdsvis, og bioactivity ble verifisert ved hjelp av en kalsium mobilisering analysen. Rekombinante proteiner ble lagret ved -80 °C, inntil de skal brukes. For å måle CCL21–Hans binding til GPR174, med CCR7 som positiv kontroll, 293T celler ble transfekte med GPR174–GFP eller CCR7–GFP fusion konstruksjoner., Alikvoter av transfekte cellene ble deretter inkubert med CCL21–Hans protein på angitt konsentrasjoner ved 37 °C i 30 min, vasket to ganger med kaldt PBS, og løst umiddelbart med 4% paraformaldehyde. Etter washings i PBS, fast celler ble farget med en fysoerytrin-konjugert-Hans antistoff (klone J095G46, Biolegend) og analysert ved flowcytometri., GFP− celler i hver prøve serveres som en uspesifikk bakgrunn farging intern kontroll, og det betyr fluorescens intensitet (MFI) av GFP+ celler farget med fysoerytrin-konjugert-Hans-antistoff, med MFI av tilsvarende GFP− celler trukket fra, ble brukt til å kvantifisere bestemt CCL21 bindende.
Måling av chemokine-utløst kalsium fluksene
Mus Gpr174 og Ccr7 ble forsterket ved PCR og klonet inn i pRK5 plasmider. HEK293T celler ble kortvarig transfekte med GPR174-uttrykke, CCR7-å uttrykke eller kontroll plasmider., Cellene ble fysisk løsrevet fra kultur fartøy 48 t etter transfection, vasket to ganger med PBS, og farget med 1 µM Indo-1 (Invitrogen) i PBS ved 37 °C i 30 min. Etter å ha blitt vasket to ganger med PBS, cellene ble resuspendert med Hanks’ balansert salt-løsning (Invitrogen) som inneholder 25 mM Hepes-og 1% FBS, og holdes på is. Når det utsettes for chemokine stimulering, celler ble første gang tatt i et vann batch ved 37 °C i 5 min inkubasjon, og deretter vurderes på en LSR II blokkdel (BD Biovitenskap) for å etablere en baseline for unstimulated staten., Cellene ble stimulert med en konsentrasjon serien av rekombinant CCL21 alt fra 0,1 ng ml−1 til 10 µg ml−1. Celler i hver tilstand ble kontinuerlig overvåket og registrert for 2 min. På slutten, ionomycin (Sigma) ble videre lagt til eksempel på en endelig konsentrasjon på 1 µg ml−1, og prøven ble ytterligere overvåket og registrert i 1 min. Indo-1(bundet)/Indo-1(gratis) forholdstall ble brukt til å indikere intracellulære Ca2+ – konsentrasjoner, som ble analysert i FlowJo (TreeStar). Den høyeste Ca2+ konsentrasjon stimulert av ionomycin ble brukt som 100% for å normalisere kalsium svar indusert av CCL21., Den EC50 ble anslått i GraphPad ved å montere en tre-parameteren, ikke-lineære dose–respons-kurve.
Immunoprecipitation og western blotting
Nylig isolert musen B-celler fra GPR174–GFP BAC transgene mus ble aktivert med 10 µg ml−1 F(ab’)2 geit anti-mus-IgM og 10 µg ml−1 anti-CD40 for 48 t. Disse aktiverte B-celler ble deretter suspendert på 2 × 107 celler per milliliter i RPMI medium som inneholder 1% FBS, og ubehandlet eller stimulert med 300 ng ml−1 CCL21 ved 37 °C i 30 min. B-cellene ble deretter umiddelbart lysert i 1% NP-40 lyse buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glyserol og proteasehemmere). For immunoprecipitation av GFP-merket GPR174, lysates 108 B-celler ble inkubert over natten med 20 µl av GFP–Felle perler (ChromoTek). Etter gjentatte tvettinger immunoprecipitates var eluted ved inkubering i 0,2 M Glysin buffer (pH 3.0) i 10 min ved romtemperatur, og deretter nøytralisert med 1 M Tris-HCl (pH 8.5). Proteiner ble separert ved SDS–PAGE og overført til polyvinylidene membran (Millipore). Membraner ble blokkert med Tris-bufret saltoppløsning som inneholder 5% BSA og 0.1% Tween 20., Å oppdage mål molekyler av immunoblotting, vi brukte kanin anti-GFP (Abcam), kanin anti-Gai-1 (Abcam), kanin anti-Gai-2 (Abcam) og kanin anti-Ga13 (Abcam) antistoffer. HRP-konjugert geit anti-kanin-antistoff ble kjøpt fra Bioeasytech. Immunoblots ble oppdaget ved hjelp av forbedrede chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific), og bildene ble analysert med ImageJ programvare.
Kvantitativ PCR
Cellene i ønsket typer ble sortert med en FACSAria III og utsatt for total RNA-ekstraksjon med RNeasy Plus Mini-eller Micro-kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner., RNA ble omvendt-transkribert med Alt-I-Ett-RT MasterMix (Abm). Kvantitativ PCR ble utført med qPCR MasterMix (Abm) på 7500 Real-Time PCR-system (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., I forhold uttrykk for mål gener mellom ulike prøvene ble sammenlignet etter normalisering mot uttrykk for rengjøring gener Actb eller Gapdh.
Statistiske data analyse
Statistikk og grafiske ble gjennomført i Prisme (Graphpad). Med mindre annet er angitt, to-tailed gruppert Student ‘ s t-tester ble brukt til å sammenligne endepunkt hjelp av ulike grupper.
Rapportering oppsummering
Ytterligere informasjon om forskning design er tilgjengelig i Nature Research Rapportering Oppsummering knyttet til dette papiret.