Hva Er Sanger-Sekvensering?
Sanger-sekvensering, også kjent som «kjede oppsigelse metode,» ble utviklet av den engelske biokjemiker Frederick Sanger og hans kolleger i 1977. Denne metoden er utformet for å bestemme rekkefølgen av nukleotid baser i et stykke av DNA (vanligvis mindre enn 1000 bp i lengde). Sanger-sekvensering med 99.,99% base nøyaktighet er ansett som «gullstandard» for validering av DNA-sekvenser, inkludert de som allerede er sekvensert gjennom neste generasjons sekvensering (NGS). Sanger-sekvensering ble brukt i det Humane Genom Prosjekt for å finne ut sekvenser av relativt små fragmenter av menneskelig DNA (900 bp eller mindre). Disse fragmentene ble brukt til å sette sammen større DNA-fragmenter og, til slutt, hele kromosomer.
Sanger-Sekvensering VS NGS
utvikling av NGS technologies har akselerert genomics forskning. NGS kan samtidig sekvens mer enn 100 gener og hele genomet med lav input-DNA., Sanger-sekvensering er fortsatt mye brukt i sekvensering feltet som det gir flere fremtredende fordeler: (i) kostnads-effektivitet for sekvensering av enkeltgener og (ii) 99.99% nøyaktighet, spesielt egnet for kontroll-sekvensering for nettstedet ditt-anvist mutagenesis eller klonet setter inn.
Hvordan Gjør Sanger-Sekvensering Arbeid?
I Sanger-sekvensering, en DNA-primer som er komplementære til malen DNA (DNA for å bli sekvensert) er brukt til å være et utgangspunkt for DNA-syntese., I nærvær av de fire deoxynucleotide triphosphates (dntp: A, G, C og T), polymerase utvider primer, ved å legge til utfyllende dNTP til mal DNA-strand. For å finne ut hvilken nukleotid er innlemmet i den kjede av nukleotider, fire dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, og ddTTP) merket med en tydelig fluorescerende fargestoff er brukt til å avslutte syntese reaksjon. I forhold til dntp, ddNTPs har et oksygen atom fjernet fra ribonucleotide, og derfor ikke kan danne en link med neste nukleotid., Følgende syntese, reaksjonen produkter er lagt til fire kjørefelt på en enkel gel avhengig av de ulike kjede-avslutning nukleotid og utsatt for en gel elektroforese. I henhold til deres størrelser, sekvens av DNA-et er dermed bestemt.
Figur 1. Strukturen i ddNTP og dNTP.
Bilde credit: «Hel-genom-sekvensering: Figur 1,» ved OpenStax College, Biologi).,
Sanger-Sekvensering Trinn
Sanger-sekvensering metoden består av 6 trinn:
(1) dobbel-strandet DNA (dsDNA) er denaturert i to single-strandet DNA (ssDNA).
(2) En primer som svarer til den ene enden av den sekvensen som er vedlagt.
(3) Fire polymerase løsninger med fire typer dntp, men bare en type ddNTP er lagt til.
(4) DNA-syntese reaksjon initierer og kjeden strekker seg frem til en avslutning nukleotid er tilfeldig incorporated.
(5) Den resulterende DNA-fragmentene er denaturert inn ssDNA.,
(6) denaturert fragmentene separeres ved gel elektroforese, og rekkefølgen er bestemt.
Figur 2. Det Sanger-sekvensering metode i 6 trinn (tilpasset fra Gauthier 2008).