CRISPR/Cas9-mediert genom redigering induserer ekson å hoppe over ved alternativ spleising eller ekson sletting

Vi har nylig brukt CRISPR å forstyrre Kras-onkogenet i to uavhengige lunge adenocarcinoma celle linjer , som ble avledet fra Kras G12D; p53 fl/fl (KP) mus . Vi isolert to single-celle kloner hver bærer frameshifting slettinger i ekson 2 (Fig., 1a og annen fil 1: Figur S1a): KP1 bærer en 2-nt «-CG» sletting i G12D allel og et 1-nt «-C» sletting i den ellers så vill-type (WT) Kras-allelet, og KP2 bærer en 2-nt «-GG» sletting. Verken klone gir full lengde Kras protein , noe som indikerer at alle de tre slettinger forstyrre Kras å lese ramme.

Frameshift mutasjoner i tidlig exons er kjent for å utløse tull-mediert forfall (NMD) , som eliminerer mrnaer med oppsigelse codons. Når vi analyserte mRNA-sekvenser (RNA-seq) data, men vi har funnet at tilsynelatende Kras mRNA-nivåer (dvs. totalt normalisert mRNA-leser) ble kun redusert med 19% i KP1 celler og 47% i KP2 celler, sammenlignet med foreldrenes KP celler (Fig. 1b). Både kloner produsert færre ekson 2 leser, men normale nivåer av ekson 1 og 3 lyder (Fig., 1c), noe som tyder på at ekson 2 kan hoppes over i KP1 og KP2 kloner. Ja, vi har oppdaget ekson 1-3 junction leser, noe som indikerer at ekson 2 var hoppet over (Fig. 1c og annen fil 1: Figur S1b). Beregning av forholdet mellom ekson 2 lyder og total leser, fant vi ut at ekson 2 er inkludert i bare 64.0 ± 9.1% av Kras leser fra KP1-klone (Fig. 1c og Tabell 1). Lignende ekson 2 hopper ble observert i KP2-kloner (Ekstra fil 1: Figur S1c)., Concordantly, revers transkripsjon av Kras mRNA etterfulgt av polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) gitt to produkter: en tilsvarte intakt Kras komplementære DNA (cDNA) og de andre tilsvarte ekson 1-3 isoformen (Fig. 1d). Den ekson 1-3 isoformen beholder en delvis Kras open reading frame som kan sette i gang oversettelse fra en ATG codon i ekson 3 (annen fil 1: Figur S2) og produsere et sterkt avkortet Kras protein.,

Redigering av Kras ikke indusere alternativ spleising genome-wide. Vi identifisert 97 alternativt kan skjøtes exons i KP1 celler og 177 hendelser i KP2 celler. KP1 og KP2 kloner delt 22 kassett inkludering eller ekskludering hendelser, med unntak av Kras ekson 2 er den største endring i både kloner (Fig. 1e og annen fil 1: Tabell S3). Dermed redigering av Kras ekson 2 spesielt indusert hoppe av Kras ekson 2., Spesielt, mens mus Kras G12D (GGU å GAU) transkripsjoner ikke hopp over ekson 2 i foreldrenes KP celler, fant vi ut at ~15% av menneskelige KRAS G12S (codon 12 GGU til AGU) transkripsjoner hoppe ekson 2 i A549 menneskelige lungekreft cellelinje (Ekstra fil 1: Figur S1d). Vi var ikke i stand til å forutsi gevinst eller tap av ekson skjøte enhancers eller lyddempere , men våre data tyder på at sekvenser i nærheten Kras codon 12 fremme ekson 2 inkludering i mus og menneske Kras. Ekson hoppe over indusert av CRISPR redigering var ikke begrenset til Kras eller til mus KP celler., En nylig studie viste at CRISPR redigering av FLOT1 ekson 3 i HeLa celler kan forårsake hoppe av ekson 3, ekson 4, eller exons 3, 4, og 5 . Vi oppdaget også sjeldne ekson å hoppe over når vi målrettet ekson 11 av LMNA i menneskelig HCT116 celler (Ekstra fil 1: Figur S3). Hoppe over LMNA ekson 11 produserer en i-ramme transkripsjonen som kan bli oversatt til et neomorphic protein.

for Å utforske ideen om at ekson hoppe kunne produsere en funksjonell i-frame avskrift, vi spurte om CRISPR-mediert redigering av Ctnnb1 ekson 3 kan indusere ekson å hoppe over og forårsake gain-of-function fenotypen., Ekson 3 av Ctnnb1 koder phosphoacceptor rester som fremmer nedbrytning av β-Catenin transkripsjonsfaktor ; genetisk eksisjon av Ctnnb1 ekson 3—som er i ramme med ekson 4—stabilisert en constitutively aktiv β-Catenin som akkumuleres i kjernen . Vi har konstruert 11 sgRNAs som er rettet mot områder langs Ctnnb1 ekson 3 (Ctnnb1-sg1 til-sg11), transduced individuelle sgRNAs i KP celler, og brukes av høy gjennomstrømning sekvensering for å analysere omfanget av redigering på sgRNA målområde i hver linje (Fig. 2b x-aksen, Ekstra fil 1: Figur S4 og Ekstra fil 2: Tabell S4)., Tre sgRNAs (sg6, sg9, og sg10) inefficiently målrettet Ctnnb1. Åtte av Ctnnb1 sgRNAs (sg1 å sg5, sg7, sg8, og sg11), men indusert indels på sine mål nettsteder med frekvenser som oversteg 20%. For eksempel, Ctnnb1-sg1 generert + T innsettinger i ca 65% av lyder (Fig. 2c). I hver populasjon målrettet av en sterk Ctnnb1 sgRNA, vi oppdaget tre RT-PCR-produkter som spenner exons 2 til 5 (Fig. 2d). Den viktigste produkt tilsvarer normalt skjøtes karakterutskrift som inneholder ekson 3. De to andre produkter som svarer til alternativt kan skjøtes transkripsjoner: en som hopper ekson 3 (dvs., ekson 2-4 skjøting, Fig. 2e) og en som hopper både exons 3 og 4 (dvs., ekson 2-5 skjøting, Fig. 2f). Ctnnb1 sgRNAs rettet mot enten DNA-strand indusert ekson hoppe og Cas9 nuclease aktivitet var viktig for ekson å hoppe over (Fig. 3a).

Western blot analyse avslørte at cellen bestander transduced med sterk sgRNAs lage en mindre ~74 kD β-Catenin protein som tilsvarer størrelse som forventet fra ekson 2-4 skjøte produktet (Fig. 2g). Full lengde β-Catenin protein ble ikke vesentlig redusert fire dager etter transduksjon. For å teste om alternativ spleising er avhengig av kontinuerlig uttrykk for Cas9 eller sgRNA i lentiviral vektorer, vi co-transfekte Cas9 og Ctnnb1-sg1 eller en ikke-målretting sgRNA kontroll., Sju dager etter transfection, når transfekte Cas9 og guide RNAs skal være tømt, undersøkte vi β-Catenin lokalisering av immunfluorescens. I mus fibroblast celler transfekte med en ikke-målrettet kontroll sgRNA, β-Catenin lokalisert til celle veikryss (Ekstra fil 1: Figur S5a). I kontrast, i mange celler transfekte med Ctnnb1-sg1, vi oppdaget β-Catenin i kjernen (Ekstra fil 1: Figur S5a)., Disse resultatene tyder på at kontinuerlig redigering er ikke nødvendig for ekson å hoppe over og at ekson 3 hopper indusert av CRISPR-mediert redigering av Ctnnb1 ekson 3 gir en gevinst-av-funksjonen β-Catenin isoformen.

Vi videre analyseres transkripsjoner som strekker seg over exons 2 til 7 i celle bestander behandlet med Ctnnb1-sg2, -sg3, og -sg5. I tillegg til full-lengde isoformen, vi har oppdaget fire transkripsjoner med ekson 2 tilsynelatende skjøtes til hver nedstrøms ekson (dvs. ekson 2-4, ekson 2-5, ekson 2-6, og ekson 2-7; Fig. 3a, b)., Vi trenger ikke forstå mekanismen av denne tilsynelatende promiskuøse ekson hoppe over indusert av Ctnnb1 ekson 3 redigering, heller ikke har vi vært i stand til å relatere promiskuøse ekson hoppe med spesifikke mål nettsteder eller indel mutasjoner i ekson 3. Likevel, vi isolert en Ctnnb1-sg3 redigert klone som antyder en mulig mekanisme (Ekstra fil 1: Figur S6a). Dette biallelic klone inneholder en 3-bp-i-ramme sletting på ett allel og et stort 832-bp sletting på den andre; den 832-bp sletting sikringer 5′ – enden av intron 2 til 3′ – enden av ekson 4 (Ekstra fil 1: Figur S6)., Vi oppdaget to transkripsjoner i disse cellene: det riktig skjøtes karakterutskrift som inneholder 3-bp sletting og en karakterutskrift som inneholder intron 2 smeltet sammen til ekson 4 (Ekstra fil 1: Figur S6c og Tabell 1). Disse resultatene tyder på at tilsynelatende ekson hoppe oppdaget i bestander av redigert celler kunne reflektere genom rearrangements som fjerner exons.

To eksperimenter som støtter ideen om at en enkelt sgRNA kan forårsake store genom slettinger som fjerner exons., For eksempel, vi isolert 15 kloner fra mus 3T3 celler kortvarig transfekte med Cas9 og Ctnnb1-sg1, og fant at fire kloner (dvs. kloner 4, 5, 13 og 15) viste tydelig ekson hoppe av RT-PCR. Genomisk PCR avslørt genom rearrangements i tre av disse klonene: store slettinger (>500 bp) og mindre slettinger (~100 bp) i kloner 4 og 15, og store innsettinger i kloner 13 og 15 (Ekstra fil 1: Figur S7)., Dessuten, etter målretting ekson 6 av p65/RelA, vi isolert en biallelic p65 klone (#15): ett allel havner en 1-nt «+A» innsetting og andre havner en 2268-bp sletting som fjerner exons 5, 6, og 7 (Ekstra fil 1: Figur S8a, c–e). I p65 klone #15, har vi oppdaget helt skjøtes karakterutskrift og et ekson 4-8 skjøte produkt (Ekstra fil 1: Figur S8c). Begge alleler kode frameshifted transkripsjoner og både p65 transkripsjoner er til stede på et lavere nivå enn WT (Ekstra fil 1: Figur S8b)., Vi har også isolert en redigert p65 klone (#31) homozygote for det samme + En innsetting som i klone #15, men klone #31 ikke produserer alternativt kan skjøtes transkripsjoner. Dermed ekson 4-8 skjøtes transkripsjonen i klone #15 resultater fra sletting av exons 5, 6, og 7. Disse store ekson sletting hendelser var uventet og ville bli savnet ved hjelp av typiske PCR-basert screening analyser.,

evnen til å forårsake en gain-of-function aktivitet ved å fremkalle ekson hoppe over eller ekson eksisjon foreslått at CRISPR-mediterte redigering ved hjelp av en enkelt sgRNA kan være en nyttig måte å delvis redde funksjonen til en sykdom genet som krever lavt nivå redning. CRISPR-mediert homologe DNA reparasjon har blitt brukt for å korrigere for tidlig stopp codon mutasjoner i Dmd-genet i mus modell av DMD, og flere grupper har brukt CRISPR å slette Dmd exons og delvis gjenopprette Dmd uttrykk . Vi har laget fire sgRNA/Cas9 lentiviruses som retter seg mot ulike områder i ekson 23 av Dmd-genet (Fig., 4a, b) og transduced musen C2C12 myoblasts, en cellelinje mye brukt som en modell for Duchenne muskeldystrofi (DMD) . I C2C12 celler transduced med Dmd sgRNAs, vi oppdaget en RT-PCR-produkt som svarer til normal skjøte produkt som inneholder ekson 23. Sekvensering disse RT-PCR-produkter som viste at bare Dmd-sg2 effektivt redigert Dmd ekson 23, som dokumentert av blandet rekkefølge topper utover sgRNA målområde (Ekstra fil 1: Figur S9). I cellene transduced med Dmd-sg2, vi har også oppdaget en RT-PCR-produktet tilsvarende ekson 22 skjøtes til ekson 24 (Fig. 4c-d)., Dermed målretting ekson 23 med en sgRNA kan være tilstrekkelig til å indusere delvis ekson hoppe og produsere en intakt dystrophin open reading frame. DMD er et klassisk eksempel på en sykdom som en liten mengde funksjonelle restaurering kan gi betydelig klinisk nytte .