Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., Gpr174-deficiënte muizen werden gegenereerd door standaard gen-targeting procedures om het open leesframe van Gpr174 te vervangen door een LacZ/neo cassette met behulp van de 129svevbrd embryonale stamcellijn (Texas a&m Institute for Genomic Medicine, TG0128). Deze gpr174-deficiënte muizen werden gedurende 12 generaties terug gekruist naar c57bl / 6 muizen. Relevante muizen op de c57bl / 6-achtergrond werden onderling gekweekt om GFP-expressieve MD4-muizen en dsRed-expressieve GPR174-voldoende of-deficiënte MD4-muizen te verkrijgen., Voor experimenten werden op leeftijd afgestemde nestgenoten tussen 6 en 12 weken oud en van de aangegeven geslachten gebruikt. De steekproefgrootte voor muisexperimenten werd empirisch bepaald, en muizen werden willekeurig toegewezen aan controle of experimentele groep. Voor de hier gepresenteerde muisexperimenten was geen verblindingnood nodig. Alle muizen werden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden en werden gebruikt in overeenstemming met de richtlijnen van de overheid en Tsinghua Institutional Animal Care and Use Committee voor dierenwelzijn.,
gpr174–GFP Bac transgene muizen
sequenties die coderen voor de glycine–glycine–glycine–serine (GGGS) linker (vier keer herhaald) en verbeterde GFP (EGFP) werden direct voor het stopcodon van het gpr174 open leesframe in de muis Bac kloon RP23-206J14 ingebracht door homologe recombinatie. Gewijzigd BAC werd gezuiverd en microinjected in pronuclei van bevruchte eicellen om transgene verslaggevers te produceren. Een stichtersmuis die positief voor GFP-uitdrukkende cellen van B in het bloed werd onderzocht werd gebruikt om verder met B6 muizen te fokken om de stam van GPR174–GFP BAC te vestigen.,
celcultuur, retrovirus en in vitro transductie
naïeve T-cellen of B-cellen werden geïsoleerd met behulp van de negatieve CD4 T-cel Isolatiekit of de naïeve B-cel Isolatiekit (Miltenyi Biotec) volgens de protocollen van de fabrikant. Om de doelgenen in B−cellen overexpressie te geven, werden gezuiverde B-cellen gedurende 1 dag geactiveerd met 1 µg ml-1 lipopolysaccharide (Sigma) alvorens spin-infected te worden met retrovirale supernatanten bij 1500 g gedurende 2 uur, zoals beschreven 18.
constructie van beenmergchimaeras
B6-ontvangende muizen werden dodelijk doorstraald door röntgenstraling (5.,5 Gy, tweemaal) en vervolgens een intraveneuze transfer van 3 × 106 geslachtsgebonden beenmergcellen toegediend, bestaande uit 80% µMT-cellen en 20% GPR174-voldoende of-deficiënte cellen. Chimaeras werden zes tot acht weken na reconstitutie gebruikt voor experimenten.
Gonadectomie
muizen na het spenen werden intraperitoneaal verdoofd met Avertin (2,5%, 0,015 ml g−1 lichaamsgewicht). Bij ovariectomie van vrouwtjesmuizen werden de eierstokken aan beide zijden blootgesteld en verwijderd door middel van bilaterale dorsale incisies., Voor orchidectomie bij mannelijke muizen, werd een mediane abdominale incisie gemaakt om testikels aan beide zijden bloot te leggen en te verwijderen. Schijnbehandelde controlemuizen ondergingen een operatie met inbegrip van bilaterale dorsale incisies of een mediane abdominale incisie zonder verwijdering van eierstokken of testikels. Chirurgische wondopeningen werden gehecht, en antibiotica en analgetica werden lokaal aangebracht. Muizen werden toegestaan om te herstellen voor acht weken voor de volgende experimenten.,
testosteronbehandeling
zes – tot acht weken oude muizen werden subcutaan geïnjecteerd met testosteron (10 mg kg−1 lichaamsgewicht) opgelost in zonnebloemzaadolie om de andere dag gedurende twee weken. Voertuigemuizen werden alleen met zonnebloemzaadolie behandeld.
adoptieve transfer, immunisatie en virale infectie
om de vorming van het kiemcentrum door MD4 B-cellen te meten, werden 105 OT-II T-cellen en 5 × 105 MD4 B-cellen van de aangegeven genotypes intraveneus overgedragen aan mannelijke B6-ontvangers, die vervolgens subcutaan werden geïmmuniseerd met 0.,5 µg lipopolysaccharide en 30 µg HEL-OVA conjugaatantigeen in aluin (Thermo Scientific). De HEL-OVA werd gemaakt door chemische crosslinking met een HydraLink conjugation kit (SoluLink) zoals eerder beschreven 19. Om de vorming van het germinaal Centrum te meten als reactie op SRBC-immunisatie of lymfocytaire choriomeningitisvirus (LCMV) infectie, werden muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 5 × 108 SRBCs (van Z. Baiji) of 2 × 105 plaque-vormende eenheden van het LCMV Armstrong virus (van L. Ye en R. Ahmed).,
EAE door MOG – eiwitimmunisatie
de sequentie die codeert voor de eerste 120 aminozuren van humaan MOG werd versterkt door polymerasekettingreactie (PCR) uit een complementaire DNA-bibliotheek in de menselijke hersenen, en gekloond tussen de ndei-en XhoI-locaties van de pET22b+ expression vector (Novagen). Humaan MOG-eiwit werd uitgedrukt in BL21(de3) Escherichia coli en gezuiverd door zijn carboxy-terminale histidine (His) – label. Eiwitzuiverheid en–concentratie werden beoordeeld met respectievelijk SDS-PAGE en BCA-eiwittest (bicinchoninezuur). Recombinante eiwitten werden bewaard bij -80 °C tot gebruik., Om EAE te induceren, werden beenmerg-chimerische dieren van de aangewezen typen subcutaan geïmmuniseerd aan de flank met 200 µg recombinant humaan MOG-eiwit geëmulgeerd in volledig Freund ‘ s adjuvans op dag 0. Muizen werden intraveneus geïnjecteerd met 200 ng pertussis toxine (Invitrogen) op dag 0 en 2. Muizen werden dagelijks op blinde wijze gecontroleerd op ziekteprogressie vanaf DAG 1. De ernst van de ziekte werd als volgt beoordeeld: 0, geen klinische symptomen; 1, verlamde staart; 2, verlies van gecoördineerde beweging en parese van de achterpoten; 2,5, verlamming van één achterpoot; 3, verlamming van beide achterpoten; 3.,5, verlamming van beide achterpoten en zwakte in voorpoten; 4, verlamming van voorpoten; en 5, stervende. Om de ernst van de ziekte te vergelijken, bestudeerden we tien muizen per aandoening per experiment en analyseerden we de ziektescores in de loop van de tijd met ANOVA in twee richtingen.
flowcytometrie
meting van antigeenspecifieke antilichaamtiters
om SRBC-specifieke antilichaamtiters te meten, hebben we 5 × 108 SRBCs gelyseerd met 1 ml dubbel gedestilleerd water en gecentrifugeerd bij 15.000 r.p.m. gedurende 20 minuten., De pellet werd geresuspendeerd in PBS en werd gebruikt om MaxiSorp enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) platen (nunc Maxisorp) ‘ s nachts te coaten bij 4 °C. Om MOG-specifieke serum antilichamen te meten, gebruikten we 2 µg ml−1 gezuiverde recombinant humaan MOG om de ELISA platen te coaten. Niet-specifieke binding werd geblokkeerd met 1% bovine serum albumine (BSA) in PBS met Tween-20 (PBST) gedurende 2 uur bij 37 °C, gevolgd door incubatie met 2× seriële verdunningen van serummonsters van geïmmuniseerde muizen gedurende 1 uur bij 37 °C., De platen werden gewassen en geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam (1/20,000) gedurende 1 uur bij 37 °C. De platen werden gewassen, ontwikkeld met 3,3′,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) en gestopt met 1 m HCl. We zetten lege putten op nul, en registreerden absorptie bij 450 nm. We gebruikten sera van unimunized muizen als negatieve controle; de cut-off waarde was de optische dichtheid bij 450 nm (OD450) van de negatieve controle vermenigvuldigd met 2,1. Een put met een OD450-waarde van niet minder dan de afkapwaarde werd als positief beschouwd., De hoogste verdunning van een monster dat positiviteit gaf is de titer van het monster.
verdeling van B-cellen door immunohistochemie
bij verschillende experimenten werden naïeve B−cellen, B−cellen die gedurende 1 uur werden geactiveerd met 10 µg ml−1 F(ab’)2 anti-muis IgM van geiten (Jackson Immunoresearch) of B-cellen die met retrovirus werden getransduceerd, overgebracht naar B6-ontvangers. Indien nodig werden deze cellen geëtiketteerd met 1 µM tetramethylrhodamine (TAMRA), 4-chloormethyl-6,8-Difluor-7-hydroxycumarine (CMF2HC) of 5-chloormethylfluoresceïne diacetaat (CMFDA) (Invitrogen)., Milten of inguinale lymfeklieren van de ontvangende muizen werden gefixeerd met 1% paraformaldehyde gedurende 12 uur en vervolgens gedehydrateerd in 30% sucrose-oplossing gedurende 12 uur bij 4 °C. Om een maximale representatie van verschillende orgaangebieden in de uiteindelijke dataset te garanderen, hebben we niet-opeenvolgende weefselsecties verwerkt en gekleurd met aangegeven antilichamen. De kleuringsreagentia omvatten eFluor450-IgD( eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), konijn anti-GFP (abcam) en Af488 geit anti-konijn IgG (Invitrogen)., Dia ‘ s werden gemonteerd met de ProlongGold Antifade reagens (Invitrogen) en onderzocht met een Olympus FV1000 rechtop microscoop. Beelden werden geanalyseerd met Imaris (Bitplane) en ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
Miltstromapreparaat
milten van muizen, ratten of varkens werden herhaaldelijk geperst en gemalen tegen een metalen gaas om rode bloedcellen en lymfocyten vrij te geven. De resterende onverzadigbare, amorfe stromale weefselelementen werden grondig gewassen met PBS voordat ze in B27 serumvrij kweekmedium (Invitrogen) werden geplaatst en gedurende 12 uur bij 37 °C geïncubeerd., Voor muizen werden stromale elementen van drie dieren gekweekt in 1 ml medium. Voor varkens werden stromale elementen uit 1 milt gekweekt in 80 ml. De resulterende kweek werd gedurende 60 minuten gecentrifugeerd bij 10.000 omwentelingen per minuut om het geconditioneerde medium te verkrijgen, dat ofwel onmiddellijk voor experimenten werd gebruikt, ofwel tot gebruik bij -20 °C werd ingevroren.
Transwell assay
B-cellen die gedurende 60 uur met 1 µg ml−1 lipopolysaccharide werden geactiveerd, werden gebruikt voor de bepaling van verschillende fracties als gevolg van biochemische fractionering., Naïeve B-cellen of B-cellen geactiveerd met 10 µg ml-1 F (ab’)2 geit anti-muis IgM (Jackson Immunoresearch) en 10 µg ml−1 anti-CD40 (kloon FGK4.5, Bio X-cel) werden gebruikt om de ccl21-geïnduceerde migratie te bepalen. Wanneer B-cellen van verschillende genotypen werden vergeleken, werden ten minste drie donormuizen van elk genotype en de behandeling gebruikt om B-cellen in elk experiment te isoleren, en nestgenoten werden altijd gebruikt. B-cellen werden gesuspendeerd bij 106 cellen per milliliter en rustten in RPMI-medium met 1% FBS bij 37 °C gedurende 1 uur., Vervolgens werd een totaal van 100 µl celsuspensie toegevoegd aan de bovenste kamer in een 5-µm-pore Transwell (Corning Costar), en een totaal van 150 µl lokstof bevattende oplossingen werd toegevoegd aan de onderste kamer. Deze oplossingen omvatten kweekmedium geconditioneerd met ruw miltstromapreparaat van muizen, kweekmedium geconditioneerd met ruw miltstromapreparaat van varkens, elutiefracties van chromatografie, kweekmedium dat recombinant CCL21 en CCL19 (Peprotech) bevat, of 18/0 LysoPS (Avanti polaire lipiden) van de aangegeven concentraties., Voor sommige experimenten werd het met muriene stroma geconditioneerde medium eerst aangevuld met een eindconcentratie van 5 µg ml−1 neutraliserende antilichamen tegen muis CCL21 of ccl19 (R&D systeem) of geit IgG isotype controle, en geïncubeerd bij 4 °C gedurende 3 uur alvorens te worden gebruikt voor de transwell assay. De antilichaamdosis was ten minste voldoende om 100 ng ml−1 CCL21 of CCL19 te neutraliseren, zoals bepaald in voorafgaande experimenten. De cellen mochten gedurende 3 uur bij 37 °C in een incubator transmigreren., De cellen die naar de bodemputten waren gemigreerd werden geteld door cytometry stroom, met fluorescente A20 cellen van bekende aantallen die onmiddellijk vóór lezing als interne tellende norm worden toegevoegd. Elke aandoening werd gemeten in drievoudige putten, tenzij anders aangegeven.
biochemische fractionering
chromatografie werd uitgevoerd met een ÄKTApurifer 10 fast protein liquid chromatography (FPLC) – systeem (GE Healthcare) bij 4 °C, met uitzondering van de laatste stap, die werd uitgevoerd met een ÄKTAmicro FPLC-systeem (GE Healthcare)., Een totaal van 1.200 ml porcine stroma-geconditioneerd medium werd aangebracht op een anionuitwisselingskolom (250 ml bedvolume) in evenwicht gebracht met buffer I (25 mM Hepes, pH 7,0). De kolom werd gewassen met drie kolomvolumes alvorens te worden geëlueerd met drie kolomvolumes van buffer I aangevuld met 1 M NaCl. De flow-through werd met buffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8,5) buffer-veranderd in 100 ml en opnieuw aangebracht op een anion-exchange kolom equilibrated met buffer II. de kolom werd gewassen met twee kolomvolumes van buffer II en geëlueerd met twee kolomvolumes van een 0,1–0,5 m lineaire NaCl gradiënt., Fracties van elk 10 ml werden verzameld en aliquots werden buffer-veranderd met RPMI 1640 voor de transwell assay. Actieve fracties werden gepoold en buffer-veranderd in 10 ml met buffer II en geladen op een heparine kolom (5 ml bed volume) equilibrated met buffer II. de kolom werd gewassen met 12 kolomvolumes van buffer II en geëlueerd met 4 kolomvolumes van 0-2 m lineaire NaCl gradiënt. Fracties van elk 2 ml werden verzameld en aliquots werden buffer-veranderd met RPMI 1640 voor de transwell assay. Actieve fracties werden opnieuw samengevoegd, buffer-veranderd in 0.,5 ml buffer I en geladen op een Superdex-75 kolom (24 ml bed volume) equilibrated met buffer I. de kolom werd vervolgens geëlueerd met een kolom volume van buffer I. fracties van elk 0,5 ml werden verzameld, en aliquots werden buffer-veranderd met RPMI 1640 voor de transwell assay. Actieve fracties werden samengevoegd en geconcentreerd in 0,5 ml om te laden op een Mono s-kolom (1 ml bedvolume) in evenwicht gebracht met buffer I. de kolom werd gewassen met 12 kolomvolumes van buffer I en geëlueerd met 25 kolomvolumes van 0-0, 5 m lineaire NaCl-gradiënt., Fracties van elk 1 ml werden verzameld en aliquots werden buffer-veranderd met RPMI 1640 voor de transwell assay. Actieve fracties werden gepoold, buffer-veranderd en geconcentreerd in 50 µl met buffer I, en opnieuw geladen op de Mono s kolom equilibrated met buffer I. de kolom werd gewassen met drie kolomvolumes van buffer I met 0,3 M NaCl, en geëlueerd met 24 kolomvolumes van 0,3–0,4 m lineaire NaCl gradiënt., Fracties van elk 1 ml werden verzameld, en aliquots werden buffer-veranderd met RPMI 1640 voor de laatste transwelltest om de fractie te identificeren die de sterkste chemoattractantactiviteit bevatte.
Massaspectrometrieanalyse
fracties van de laatste zuiveringsstap werden geconcentreerd in 50 µl en geanalyseerd op 12% NuPAGE gels (Invitrogen). Gels werden gekleurd met de Pierce silver stain voor massaspectrometrie (Thermo Fisher Scientific) volgens het Protocol van de fabrikant., Banden met verhoogde intensiteit in de fractie die de sterkste chemoattractantactiviteit bevat, werden verwijderd en onderworpen aan in-gel-vertering alvorens te worden geanalyseerd met een Q Exactive HF-massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific). Massaspectrometrie gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Swissprot database met de mascotte zoekmachine.
his-tagged recombinant CCL21 and binding assay
de muis ccl21 codering werd versterkt uit c57bl / 6 muis milt cDNA en gekloond tussen de ndei en XhoI sites van de pET22b+ expression vector (Novagen), die een C-terminal zijn tag levert., Het recombinant eiwit werd uitgedrukt in BL21 (DE3) muizen en gezuiverd door zijn tag. Eiwitzuiverheid en–concentratie werden beoordeeld met respectievelijk SDS-PAGE en BCA-test en de bioactiviteit werd geverifieerd met een calciummobilisatietest. Recombinante eiwitten werden bewaard bij -80 °C tot gebruik. Om ccl21–zijn band aan GPR174, met ccr7 als positieve controle te meten, werden 293T cellen getransfecteerd met gpr174–GFP of ccr7–GFP fusieconstructies., Aliquots van getransfecteerde cellen werden vervolgens geïncubeerd met CCL21 – zijn eiwit bij aangegeven concentraties bij 37 °C gedurende 30 min, tweemaal gewassen met koude PBS, en onmiddellijk gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Na het wassen in PBS, werden de vaste cellen bevlekt met een phycoerythrin-geconjugeerd anti-zijn antilichaam (kloon J095G46, Biolegend) en geanalyseerd door cytometry stroom., GFP-cellen in elke steekproef dienden als niet-specifieke achtergrondkleuring interne controle, en de gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) van GFP + cellen gekleurd met phycoerythrin-geconjugeerd anti-zijn antilichaam, met de MFI van overeenkomstige GFP− cellen afgetrokken, werd gebruikt om specifieke ccl21 binding te kwantificeren.
meting van door chemokine veroorzaakte calciumfluxen
muis Gpr174 en Ccr7 werden door PCR versterkt en gekloond in het prk5-plasmide. HEK293T-cellen werden tijdelijk getransfecteerd met gpr174-expressie, CCR7-expressie of controleplasmide., Cellen werden fysiek losgemaakt van de kweekvat 48 h na transfectie, gewassen tweemaal met PBS, en gekleurd met 1 µM indo-1 (Invitrogen) in PBS bij 37 °C gedurende 30 min. Na tweemaal met PBS gewassen te zijn, werden de cellen geresuspendeerd met de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks (Invitrogen) met 25 mM Hepes en 1% FBS, en op ijs bewaard. Wanneer onderworpen aan chemokinestimulatie, werden de cellen eerst in een waterpartij bij 37 °C gedurende 5 min van incubatie gebracht, en dan beoordeeld op een cytometer LSR II (Biosciences BD) om de basislijn voor de niet-getimuleerde toestand vast te stellen., Cellen werden gestimuleerd met een concentratieserie van recombinant ccl21 variërend van 0,1 ng ml−1 tot 10 µg ml−1. Cellen bij elke aandoening werden continu gecontroleerd en gedurende 2 minuten geregistreerd. Aan het einde werd ionomycine (Sigma) verder toegevoegd aan het monster in een uiteindelijke concentratie van 1 µg ml−1, en het monster werd verder gecontroleerd en geregistreerd gedurende 1 min. Indo-1(gebonden)/Indo-1(vrije) verhoudingen werden gebruikt om intracellulaire Ca2+ concentraties aan te geven, zoals geanalyseerd in FlowJo (TreeStar). De hoogste concentratie Ca2+ die door ionomycin wordt bevorderd werd gebruikt als 100% om de calciumrespons te normaliseren die door CCL21 wordt veroorzaakt., De EC50 werd geschat in GraphPad door gebruik te maken van een drie–parameter, niet-lineaire dosis-respons curve.
Immunoprecipitation en western blotting
Vers geïsoleerde muis B-cellen van GPR174–GFP BAC transgene muizen werden geactiveerd met 10 µg ml−1 F(ab’)2 geit anti-muis-IgM en 10 µg ml−1 anti-interactie cd40 voor 48 uur. Deze geactiveerde B-cellen werden vervolgens opgehangen aan 2 × 107 cellen per milliliter in RPMI medium met 1% FBS en onbehandeld of gestimuleerd met 300 ng ml−1 CCL21 bij 37 °C gedurende 30 min. B-cellen werden vervolgens onmiddellijk gelyseerd in 1% NP-40 lysis buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glycerol en proteaseremmers). Voor immunoprecipitation van GFP-geëtiketteerd gpr174, werden de lysaten van 108 cellen van B ‘ s nachts geïncubeerd met 20 µl GFP–Valparels (ChromoTek). Na herhaalde wasbeurten werden immunoprecipitaten geëlueerd door incubatie in 0,2 m Glycinebuffer (pH 3,0) gedurende 10 min bij kamertemperatuur en vervolgens geneutraliseerd met 1 m Tris-HCl (pH 8,5). Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar polyvinylideenmembraan (Millipore). Membranen werden geblokkeerd met Tris-gebufferde zoutoplossing met 5% BSA en 0,1% Tween 20., Om doelmolecules door immunoblotting te ontdekken, gebruikten wij konijn anti-GFP (Abcam), konijn anti-Gai-1 (Abcam), konijn anti-Gai-2 (Abcam) en konijn anti-Ga13 (Abcam) antilichamen. HRP-geconjugeerde geit anti-konijn antilichaam werd gekocht van Bioeasytech. Immunobloten werden ontdekt met behulp van verbeterde chemiluminescentie (Thermo Fisher Scientific), en beelden werden geanalyseerd met ImageJ software.
kwantitatieve PCR
cellen van de gewenste types werden gesorteerd met een FACSAria III en onderworpen aan totale RNA-extractie met de RNeasy Plus Mini of Micro kit (Qiagen) volgens de instructies van de fabrikant., RNA werd omgekeerd getranscribeerd met alles-in-één RT MasterMix (Abm). Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met qPCR MasterMix (Abm) op een 7500 Real-Time PCR-systeem (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., De relatieve uitdrukking van doelgenen onder verschillende steekproeven werd vergeleken na normalisatie tegen uitdrukking van de huishoud genen Actb of Gapdh.
statistische gegevensanalyse
statistieken en grafieken werden uitgevoerd in Prism (Graphpad). Tenzij anders aangegeven, twee-tailed unpaired Student ‘ S t-tests werden gebruikt om eindpunt middelen van verschillende groepen te vergelijken.
Rapporteringssamenvatting
nadere informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de samenvatting van de Nature Research Reporting die aan dit document is gekoppeld.