Wat Is Sanger Sequencing?
Sanger sequencing, ook bekend als de “chain termination method”, werd ontwikkeld door de Engelse biochemicus Frederick Sanger en zijn collega ‘ s in 1977. Deze methode wordt ontworpen voor het bepalen van de opeenvolging van nucleotidebasissen in een stuk van DNA (algemeen minder dan 1.000 bp in lengte). Sanger die met 99 rangschikken.,99% basisnauwkeurigheid wordt beschouwd als de” gouden standaard ” voor het valideren van DNA-sequenties, met inbegrip van die welke reeds zijn gesequenced door de volgende generatie sequencing (NGS). Het rangschikken van Sanger werd gebruikt in het menselijke genoomproject om de opeenvolgingen van vrij kleine fragmenten van menselijk DNA (900 bp of minder) te bepalen. Deze fragmenten werden gebruikt om grotere fragmenten van DNA en, uiteindelijk, volledige chromosomen samen te stellen.
Sanger Sequencing VS NGS
de ontwikkeling van NGS-technologieën heeft genomicaonderzoek versneld. NGS kan gelijktijdig meer dan 100 genen en gehele genomen met low-input DNA rangschikken., Het rangschikken van Sanger blijft wijd gebruikt in het rangschikken van gebied aangezien het verscheidene prominente voordelen aanbiedt: (i) kostenefficiëntie voor het rangschikken van enige genen en (ii) 99.99% nauwkeurigheid, vooral geschikt voor verificatie die voor plaats-gerichte mutagenese of gekloonde tussenvoegsels rangschikken.
Hoe werkt het rangschikken van Sanger?
bij het rangschikken van Sanger wordt een DNA-primer die complementair is aan het template-DNA (het DNA dat moet worden gesequenced) gebruikt als uitgangspunt voor de DNA-synthese., In aanwezigheid van de vier deoxynucleotidetrifosfaten (dNTPs: A, G, C, en T), breidt de polymerase de inleiding uit door de aanvullende dntp aan de bundel van malplaatjedna toe te voegen. Om te bepalen welke nucleotide in de keten van nucleotiden wordt opgenomen, worden vier dideoxynucleotidetrifosfaten (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, en ddTTP) geëtiketteerd met een verschillende fluorescente kleurstof gebruikt om de synthesereactie te beëindigen. Vergeleken bij dNTPs, heeft ddNTPs een zuurstofatoom dat uit ribonucleotide wordt verwijderd, vandaar kan geen verbinding met volgende nucleotide vormen., Na synthese, worden de reactieproducten geladen in vier stegen van één enkel gel afhankelijk van diverse ketting-eindigend nucleotide en onderworpen aan gelelektroforese. Volgens hun grootte, wordt de opeenvolging van DNA zo bepaald.
figuur 1. De structuur van ddNTP en dNTP.
Image credit: “Whole-genome sequencing: Figure 1,” door OpenStax College, Biology).,
Sanger Sequencing Steps
De Sanger sequencing methode bestaat uit 6 stappen:
(1) het dubbelstrengs DNA (dsDNA) wordt gedenatureerd tot twee enkelstrengs DNA (ssDNA).
(2) een primer die overeenkomt met een einde van de reeks is bijgevoegd.
(3) vier polymeraseoplossingen met vier typen dNTPs maar slechts één type ddNTP worden toegevoegd.
(4) de DNA-synthesereactie start en de keten breidt zich uit totdat een nucleotide van de eindreactie willekeurig is opgenomen.
(5) de resulterende DNA-fragmenten worden gedenatureerd tot ssDNA.,
(6) de gedenatureerde fragmenten worden gescheiden door gelelektroforese en de sequentie wordt bepaald.
Figuur 2. Het rangschikken van Sanger methode in 6 stappen (aangepast van Gauthier 2008).