CRISPR / Cas9-gemedieerde genoombewerking induceert exon overslaan door alternatieve splicing of exon deletie

onlangs gebruikten we CRISPR om het Kras-oncogeen te verstoren in twee onafhankelijke long adenocarcinoomcellijnen, die werden afgeleid van Kras G12D; p53 fl/fl (KP) muizen . We hebben twee eencellige klonen geïsoleerd die elk frameshifting-verwijderingen in exon 2 bevatten (Fig., 1a en aanvullend bestand 1: Figuur S1a): KP1 draagt een 2-nt “-CG”- schrapping in het g12d-allel en een 1-nt “- C” – schrapping in het anders wild-type (WT) Kras-allel; en KP2 draagt een 2-nt “- GG” – schrapping. Geen van beide klonen produceert volledige Kras-eiwit, wat aangeeft dat alle drie de verwijderingen het Kras-leesframe verstoren.

Frameshiftmutaties in vroege exons zijn bekend dat ze nonsense-mediated decay (NMD) veroorzaken , waardoor mRNA ‘ s met voortijdige terminatiecodons worden geëlimineerd. Toen we mRNA-sequencing (RNA-seq) gegevens analyseerden, vonden we echter dat de schijnbare kras mRNA-niveaus (d.w.z. totaal genormaliseerde mRNA-reads) slechts met 19% werden verminderd in KP1-cellen en 47% in KP2-cellen, vergeleken met ouderlijke KP-cellen (Fig. 1 ter). Beide klonen produceerden minder exon 2 reads, maar normale niveaus van exon 1 en 3 reads (Fig., 1c), wat suggereert dat exon 2 zou kunnen worden overgeslagen in de KP1 en KP2 klonen. Inderdaad, we gedetecteerd exon 1-3 junction leest, wat aangeeft dat exon 2 werd overgeslagen (Fig. 1c en aanvullend bestand 1: Figuur S1b). Het berekenen van de verhouding tussen exon 2 leest en totaal leest, vonden we dat exon 2 is opgenomen in slechts 64,0 ± 9,1% van Kras leest van KP1-kloon (Fig. 1c en Tabel 1). Soortgelijke exon 2 overslaan werd waargenomen in KP2-klonen (aanvullend bestand 1: Figuur S1c)., Concordantly, omgekeerde transcriptie van Kras mRNA gevolgd door polymerasekettingreactie (RT-PCR) leverde twee producten op: één kwam overeen met intact kras complementair DNA (cDNA) en de andere kwam overeen met de exon 1-3 isovorm (Fig. 1d). De exon 1-3 isovorm behoudt een gedeeltelijk Kras open leesframe dat Vertaling van een ATG codon in exon 3 (aanvullend dossier 1: Figuur S2) zou kunnen initiëren en een ernstig afgekapt kras eiwit produceren.,

bewerken van Kras induceerde geen alternatieve splicing genoombrede. We identificeerden 97 alternatief gesplitste exonen in KP1-cellen en 177 gebeurtenissen in KP2-cellen. KP1 en KP2 klonen deelden 22 cassette insluiting of uitsluiting gebeurtenissen, met de uitsluiting van Kras exon 2 is de grootste verandering in beide klonen (Fig. 1e en aanvullend bestand 1: tabel S3). Zo veroorzaakte het bewerken van Kras exon 2 specifiek het overslaan van Kras exon 2., Met name, terwijl muis Kras g12d (GGU naar GAU) transcripten niet overslaan exon 2 in ouderlijke KP cellen, vonden we dat ~15% van de menselijke KRAS G12S (codon 12 GGU naar AGU) transcripten overslaan exon 2 in de a549 menselijke longkanker cellijn (aanvullend bestand 1: Figuur S1D). We waren niet in staat om de winst of het verlies van exon splice versterkers of geluiddempers te voorspellen , maar onze gegevens suggereren dat sequenties in de buurt van Kras codon 12 exon 2 inclusie in muizen en mensen Kras bevorderen. Exon overslaan veroorzaakt door CRISPR bewerken was niet beperkt tot Kras of muis KP cellen., Een recente studie toonde aan dat het uitgeven van CRISPR van FLOT1 exon 3 in HeLa cellen kan leiden tot het overslaan van exon 3, exon 4, of exons 3, 4, en 5 . We ontdekten ook onregelmatig exon overslaan toen we gericht exon 11 van LMNA in menselijke hct116 cellen (extra bestand 1: Figuur S3). Het overslaan van LMNA exon 11 produceert een in-frame transcript dat kan worden vertaald in een neomorf eiwit.

om het idee verder te onderzoeken dat exon overslaan een functioneel in-frame transcript zou kunnen produceren, vroegen we ons af of CRISPR-gemedieerde bewerking van Ctnnb1 exon 3 exon overslaan zou kunnen veroorzaken en een gain-of-function fenotype zou kunnen veroorzaken., Exon 3 van Ctnnb1 codeert fosfoacceptorresiduen die de afbraak van de β-catenine transcriptiefactor bevorderen ; genetische excisie van Ctnnb1 exon 3—dat in het kader van exon 4 is-stabiliseert een constitutief actief β-catenine dat zich ophoopt in de kern . Wij ontwierpen 11 sgRNAs die gebieden langs Ctnnb1 exon 3 (Ctnnb1-sg1 aan-sg11) richten, transduced individuele sgRNAs in KP cellen, en gebruikten hoog-productie het rangschikken om de omvang van het uitgeven op de sgrna-doelplaats in elke lijn te analyseren (Fig. 2b x-as, aanvullend bestand 1: Figuur S4 en aanvullend bestand 2: Tabel S4)., Drie sgRNAs (sg6, sg9 en sg10) waren inefficiënt gericht op Ctnnb1. Acht van de ctnnb1 sgRNAs (sg1 tot sg5, sg7, sg8 en sg11), echter induceerden indels op hun doelplaatsen met frequenties die 20% overschreden. Bijvoorbeeld, ctnnb1-sg1 gegenereerd + t inserties in ongeveer 65% Van Leest (Fig. 2c). In elke populatie gericht door een sterke Ctnnb1 sgRNA, ontdekten we drie RT-PCR-producten die exons 2 tot 5 overspannen (Fig. 2d). Het belangrijkste product komt overeen met de normaal gesplitste transcript dat exon 3 omvat. De andere twee producten komen overeen met alternatief gesplitste transcripten: één die exon 3 (d.w.z., exon 2-4 splicing, Fig. 2e) en een die zowel exons 3 en 4 overslaat (dat wil zeggen, exon 2-5 splicing, Fig. 2f). Ctnnb1 sgrnas gericht of DNA bundel veroorzaakte exon overslaan en Cas9 nuclease activiteit was essentieel voor exon overslaan (Fig. 3a).

Western blot analyse toonde aan dat celpopulaties getransduceerd met de sterke sgrna ‘ s een kleiner ~74 kD β-catenine-eiwit produceren dat in grootte overeenkomt met wat verwacht wordt van het exon 2-4 splice product (Fig. 2g). Het volledige β-catenine-eiwit was vier dagen na transductie niet significant uitgeput. Om te testen of het alternatieve splicing afhankelijk is van de continue expressie van Cas9 of sgRNA in de lentiviral vectoren, co-transfected Cas9 en Ctnnb1-sg1 of een niet-targeting sgrna controle., Zeven dagen na transfectie, wanneer transfected Cas9 en gids RNAs zouden moeten worden uitgeput, onderzochten wij β-Catenin lokalisatie door immunofluorescentie. In muis fibroblast cellen getransfecteerd met een niet-targeting controle sgrna, β-Catenin gelokaliseerd aan celverbindingen (extra bestand 1: Figuur S5A). In veel met Ctnnb1-sg1 getransfecteerde cellen daarentegen, ontdekten we β-catenine in de kern (aanvullend bestand 1: Figuur S5a)., Deze resultaten suggereren dat continue bewerking niet vereist is voor exon overslaan en dat exon 3 overslaan veroorzaakt door CRISPR-gemedieerde bewerking van Ctnnb1 exon 3 een gain-of-function β-Catenin isovorm produceert.

verder analyseerden we transcripten die exons 2 tot 7 in celpopulaties die behandeld werden met Ctnnb1-sg2, -sg3 en-sg5. Naast de full-length isovorm, ontdekten we vier transcripten met exon 2 Blijkbaar verbonden aan elke stroomafwaartse exon (dwz exon 2-4, exon 2-5, exon 2-6, en exon 2-7; Fig. 3a, b)., We begrijpen niet het mechanisme van dit schijnbaar promiscue exon overslaan veroorzaakt door Ctnnb1 exon 3 bewerken, noch zijn we in staat geweest om promiscue exon overslaan correleren met specifieke doelplaatsen of Indel mutaties in exon 3. Niettemin hebben we een ctnnb1-sg3 bewerkte kloon geà soleerd die een potentieel mechanisme suggereert (aanvullend bestand 1: Figuur S6A). Deze biallelische kloon bevat een 3-bp in-frame schrapping op een allel en een grote 832-bp schrapping op de andere; de 832-bp schrapping fuseert het 5 ‘einde van intron 2 tot het 3’ einde van exon 4 (aanvullend bestand 1: Figuur S6)., We detecteerden twee transcripten in deze cellen: het correct gesplitste transcript dat de 3-bp-verwijdering omvat en een transcript dat intron 2 omvat gefuseerd naar exon 4 (extra bestand 1: Figuur S6c en Tabel 1). Deze resultaten suggereren dat het schijnbare exon overslaan ontdekt in populaties van bewerkte cellen genoom herschikkingen kon weerspiegelen die exons verwijderen.

twee experimenten ondersteunen het idee dat een enkele sgRNA grote genomische deleties kan induceren die exons verwijderen., We hebben bijvoorbeeld 15 klonen geïsoleerd van muis 3T3 cellen die tijdelijk getransfecteerd zijn met Cas9 en Ctnnb1-sg1, en vonden dat vier klonen (dat wil zeggen klonen 4, 5, 13 en 15) duidelijk exon overslaan door RT-PCR lieten zien. Genomische PCR onthulde genoom herschikkingen in drie van deze klonen: grote deleties (>500 bp) en kleinere deleties (~100 bp) in klonen 4 en 15, en grote inserties in klonen 13 en 15 (aanvullend bestand 1: Figuur S7)., Bovendien, na het targeten van exon 6 van p65/RelA, isoleerden we een biallelische P65 kloon (#15): een allel bevat een 1-nt “+A” invoeging en de andere bevat een 2268-BP verwijdering die exons 5, 6 en 7 verwijdert (extra bestand 1: Figuur S8A, c–e). In P65 clone # 15 detecteerden we het volledig gesplitste transcript en een exon 4-8 splice product (extra bestand 1: Figuur S8c). Beide allelen coderen frameshifted transcripten en beide P65 transcripten zijn aanwezig op lagere niveaus dan WT (extra dossier 1: Figuur S8B)., We hebben ook een bewerkte P65 kloon (#31) homozygoot geà soleerd voor dezelfde + a invoeging als in kloon #15, maar kloon #31 produceert geen alternatief gesplitste transcripten. Dus het exon 4-8 gesplitste transcript in kloon #15 is het resultaat van het verwijderen van exons 5, 6 en 7. Deze grote exon schrapping gebeurtenissen waren onverwacht en zou worden gemist met behulp van typische PCR-gebaseerde screening assays.,

het vermogen om een gain-of-function-activiteit te veroorzaken door exon-overslaan of exon-excisie te induceren, suggereerde dat CRISPR-meditated editing met behulp van een enkele sgRNA een nuttige manier zou kunnen zijn om functie gedeeltelijk te redden naar een ziektegen waarvoor low-level rescue vereist is. De CRISPR-bemiddelde homologe reparatie van DNA is gebruikt om voortijdige veranderingen van het eindcodon in het DMD-gen in een muismodel van DMD te corrigeren en verscheidene groepen hebben CRISPR gebruikt om DMD-exons te schrappen en DMD-uitdrukking gedeeltelijk te herstellen . We ontwierpen vier sgrna / Cas9 lentivirussen die zich richten op verschillende plaatsen in exon 23 van het DMD-gen (Fig., 4a, b) en transduced muis C2C12 myoblasten, een cellijn veel gebruikt als een model voor Duchenne spierdystrofie (DMD). In C2C12-cellen die zijn getransduceerd met Dmd sgRNAs, hebben we een RT-PCR-product gedetecteerd dat overeenkomt met het normale lasproduct dat exon 23 bevat. Het rangschikken van deze RT-PCR-producten toonde aan dat alleen DMD-sg2 DMD exon 23 efficiënt bewerkte, zoals blijkt uit gemengde opeenvolgingspieken voorbij de sgrna-doelplaats (aanvullend dossier 1: Figuur S9). In cellen die met DMD-sg2 zijn getransduceerd, hebben we ook een RT-PCR-product gedetecteerd dat overeenkomt met exon 22, gekoppeld aan exon 24 (Fig. 4c, d)., Dus exon 23 richten met één sgRNA zou voldoende kunnen zijn om gedeeltelijk exon overslaan te veroorzaken en een intact dystrofine open leesframe te produceren. DMD is een klassiek voorbeeld van een ziekte waarbij een kleine hoeveelheid functioneel herstel aanzienlijk klinisch voordeel kan bieden .