Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., Ratos com deficiência em GPR174 foram gerados por procedimentos padrão de direcionamento de genes para substituir o quadro de leitura aberta do Gpr174 por um cassette LacZ/neo usando a linha de células estaminais embrionárias embrionárias de 129SvEvBrd (Texas a&m Institute for Genomic Medicine, TG0128). Estes ratos com deficiência em GPR174 foram submetidos a uma cirurgia de ressecção para C57BL/6 ratos durante 12 gerações. Ratos relevantes no fundo C57BL / 6 foram enterrados para obter ratos MD4 que expressam GFP e ratos GPR174 que expressam dsRed-suficientes ou deficientes MD4., Foram utilizados em experiências ninhada com idades compreendidas entre as 6 e as 12 semanas de idade e dos sexos indicados. Tamanhos de amostra para experimentos com mouse foram determinados empiricamente, e ratos foram distribuídos aleatoriamente para controlar ou grupo experimental. Não foi necessário cegar para as experiências com ratos apresentadas aqui. Todos os ratos foram mantidos em condições específicas livres de agentes patogénicos e foram utilizados de acordo com as normas governamentais e Tsinghua Institutional Animal Care and Use Committee guidelines for animal welfare.,
GPR174–GFP BAC ratos transgênicos
Seqüências de codificação para os glicina–glicina–glicina–serina (GGGS) linker (repetido quatro vezes) e o avançado GFP (EGFP) foram inseridas imediatamente antes do codão stop do GPR174 open reading frame no mouse clone de BAC RP23-206J14 por recombinação homóloga. O BAC modificado foi purificado e microinjetado no pronúcleo de óvulos fertilizados para gerar repórteres transgênicos. Um rato fundador que foi rastreado positivo para as células B do sangue expressando GFP foi usado para criar mais ratos B6 para estabelecer a estirpe BAC GPR174–GFP.,culturas celulares, retrovírus e transdução in vitro
células T ingénuas ou células B foram isoladas utilizando o Kit de isolamento negativo das células T CD4 ou o Kit de isolamento das células B ingénuo (Miltenyi Biotec) de acordo com os protocolos do fabricante. Para sobreexpressar genes-alvo em células B, as células B purificadas foram activadas com 1 µg de ml−1 lipopolissacárido (Sigma) durante 1 dia antes de serem infectadas com sobrenadantes retrovirais a 1500 g durante 2 h, como descrito 18.
construção de quimeras da medula óssea
B6 ratos receptores foram irradiados letalmente por raios-X (5.,5 Gy, duas vezes) e, em seguida, uma transferência intravenosa de 3 × 106 células da medula óssea com correspondência sexual, consistindo em 80% de células µMT e 20% de células GPR174-suficientes ou deficientes. Chimaeras foram usadas em experimentos seis a oito semanas após a reconstituição.após o desmame, os ratinhos foram anestesiados com avertina (2, 5%, 0, 015 ml g−1 peso corporal) intraperitoneal. Para a ovariectomia de ratinhos fêmea, os ovários de ambos os lados foram expostos e removidos através de incisões dorsais bilaterais., Para a orquidectomia em ratinhos machos, foi feita uma incisão abdominal mediana para expor e remover testículos de ambos os lados. Os ratos de controlo operados pelo Sham foram submetidos a cirurgia incluindo incisões dorsais bilaterais ou uma incisão abdominal mediana sem remoção de ovários ou testículos. As aberturas das feridas cirúrgicas foram suturadas, e antibióticos e analgésicos foram aplicados localmente. Ratos foram autorizados a se recuperar por oito semanas antes de experimentos subsequentes.,o tratamento com testosterona em ratinhos de seis a oito semanas foi injectado por via subcutânea com testosterona (10 mg kg – 1 peso corporal) dissolvida em óleo de girassol, em dias alternados, durante duas semanas. Os ratos de controlo do veículo foram tratados apenas com óleo de girassol.
transferência adoptiva, imunização e infecção viral
para medir a formação do centro germinal pelas células MD4 B, 105 células T OT-II e 5 × 105 células MD4 B dos genótipos indicados foram transferidos por via intravenosa para os receptores B6 do sexo masculino, os quais foram subsequentemente imunizados por via subcutânea com 0.,5 µg de lipopolissacárido e 30 µg de antigénio conjugado HEL–OVA em alum (termo científico). O HEL-OVA foi feito por crosslinking químico com um kit de conjugação HydraLink (SoluLink) como descrito anteriormente 19. Para medir a formação do centro germinal em resposta à imunização do SRBC ou à infecção pelo vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), os ratos foram injectados intraperitonealmente com 5 × 108 SRBCs (a partir de Z. Baiji) ou 2 × 105 unidades formadoras de placas do vírus Armstrong LCMV (a partir de L. Ye e R. Ahmed).,
EAE by MOG protein immunization
The sequence encoding the first 120 amino acids of human MOG was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from a human brain complementary DNA library, and cloned between the NdeI and XhoI sites of the pET22b+ expression vector (Novagen). A proteína MOG humana foi expressa em BL21(DE3) Escherichia coli e purificada pela sua marca de histidina (sua) carboxi-terminal. A pureza e a concentração das proteínas foram avaliadas, respectivamente, pelo método SDS–PAGE e pelo método do ácido bicinchonínico (BCA). As proteínas recombinantes foram conservadas a -80 °C até à sua utilização., Para induzir EAE, os animais quiméricos da medula óssea de tipos indicados foram imunizados por via subcutânea no flanco com 200 µg de proteína MOG humana recombinante emulsionada no adjuvante completo de Freund no dia 0. Os ratos foram injectados por via intravenosa com 200 ng de toxina da pertussis (Invitrogen) nos dias 0 e 2. Os ratinhos foram monitorizados diariamente de forma cega para a progressão da doença a partir do dia 1. A gravidade da doença foi avaliada da seguinte forma: 0, sem sinais clínicos; 1, cauda paralisada; 2, perda de movimento coordenado e paresia dos membros posteriores; 2, 5, paralisia de um membro posterior; 3, paralisia de ambos os membros posteriores; 3.,5, paralisia dos membros traseiros e fraqueza dos membros dianteiros; 4, paralisia dos membros dianteiros; e 5, moribundo. Para comparar a gravidade da doença, estudámos dez ratos por condição por experiência, e analisámos os resultados da doença ao longo do tempo com uma ANOVA bidireccional.
citometria de Fluxo
de Medição de antigénio-anticorpo específico de títulos
A medida SRBC anticorpos específicos de títulos, nós lisadas 5 × 108 SRBCs com 1 ml duas vezes com água destilada e centrifugado-los em 15.000 r.p.m. por 20 min., O sedimento foi ressuspendido em PBS e utilizado para revestir as placas de imunoabsorção enzimática de MaxiSorp (Elisa) (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4 °C. para medir os anticorpos séricos específicos de MOG, utilizámos 2 µg ml-1 de MOG humano recombinante purificado para revestir as placas ELISA. A ligação não específica foi bloqueada com 1% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS com Tween-20 (PBST) durante 2 h a 37 ° C, seguida de incubação com 2× diluições em série de amostras de soro de ratinhos imunizados durante 1 h a 37 ° C., As placas foram lavadas e incubadas com peroxidase de rábano (HRP) conjugado anti-mouse IgG anticorpo secundário (1/20,000) por 1 h a 37 °C. as Placas foram lavadas, desenvolvido com 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) e parou com 1 M de HCl. Colocamos os poços em branco como zero, e registamos absorvância a 450 nm. Nós usamos soros de ratos não imunizados como o controle negativo; o valor de corte foi a densidade óptica a 450 nm (OD450) do controle negativo multiplicado por 2.1. Um poço com um valor OD450 não inferior ao valor-limite foi considerado positivo., A diluição mais elevada de uma amostra que deu positividade é o título da amostra.
a Distribuição de células B, por imunohistoquímica
Para vários experimentos, ingênua, células B, células B ativadas para 1 h com 10 µg ml−1 F(ab’)2 de cabra anti-mouse IgM (Jackson Immunoresearch), ou células B transformados com retrovírus foram transferidos para B6 destinatários. Quando necessário, estas células foram rotuladas com tetrametilrhodamina (TAMRA) de 1 µM, diacetato de 4-clorometil-6,8-difluoro-7-hidroxicumarina (CMF2HC) ou diacetato de 5-clorometilfluoresceína (CMFDA) (Invitrogeno)., Baço ou linfonodos inguinais do destinatário ratos foram corrigidos com 1% de paraformaldeído para 12 h e, em seguida, desidratado em 30% solução de sacarose por 12 h a 4 °C. Para garantir o máximo de representação dos diferentes órgãos regiões no final de conjunto de dados, foram processadas não secções de tecido e manchado com o indicado anticorpos. Os reagentes de coloração incluído eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), de coelho anti-GFP (abcam), e AF488 de cabra anti-IgG de coelho (Invitrogen)., As lâminas foram montadas com o reagente Antifade prolongado (Invitrogen) e examinadas com um microscópio na vertical Olimpo FV1000. Foram analisadas imagens com Imaris (Bitplane) e ImageJ 1,46 r (Institutos Nacionais de saúde).preparação do estroma Esplénico Speens de ratinhos, ratos ou suínos foram repetidamente prensados e moídos contra uma malha metálica para libertar glóbulos vermelhos e linfócitos. Os restantes elementos do tecido estromal amórfico e insuspeito foram cuidadosamente lavados com PBS antes de serem colocados no meio de cultura isento de soro B27 (Invitrogénio) e incubados a 37 °C durante 12 h., No caso dos ratos, os elementos estromais de três animais foram cultivados em meio de 1 ml. No caso dos suínos, os elementos estromais de 1 baço foram cultivados em 80 ml. A cultura resultante foi centrifugada a 10 000 rpm durante 60 minutos para obter o meio condicionado, que foi imediatamente utilizado para experiências ou congelado a -20 °C até à sua utilização.as células de Transwell activadas com 1 µg de ml−1 lipopolissacarídeo durante 60 h foram utilizadas para testar diferentes fracções resultantes do fraccionamento bioquímico., Foram utilizadas células B ingénuas ou células B activadas com 10 µg ml-1 F (ab’) 2 IgM cabra anti-rato (Jackson Immunoresearch) e 10 µg ml−1 Anti-CD40 (clone FGK4.5, Bio X Cell) para o ensaio da migração induzida pelo CCL21. Quando foram comparadas células B de diferentes genótipos, foram utilizados pelo menos três ratos dadores de cada genótipo e o tratamento para isolar células B em cada experiência, tendo sido sempre utilizados os ninhada. As células B foram suspensas a 106 células por mililitro e repousadas em meio IPR contendo 1% de FBS a 37 °C durante 1 h., Em seguida, adicionou-se à câmara superior um total de 100 µl de suspensão de células num Transwell de 5-µm-poro (Costar de Corning), e adicionou-se à câmara inferior um total de 150 µl de soluções contendo atratantes. Estas soluções incluem meio de cultura condicionado, com uma crua mouse esplênica estroma, preparação de meio de cultura condicionado, com reduções de suínos esplênica estroma de preparação, de eluição frações da cromatografia, meio de cultura contendo recombinante CCL21 e CCL19 (Peprotech), ou 18/0 LysoPS (Avanti Polar Lipids) de indicação de concentrações., Para alguns experimentos, murino estroma-condicionado de médio primeiro foi complementada com uma concentração final de 5 µg ml−1 de anticorpos neutralizantes contra mouse CCL21 ou CCL19 (R&D sistema) ou IgG de cabra isotype de controle, e incubadas a 4 °C por 3 h, antes de serem utilizados para a transwell ensaio. A dose de anticorpos foi pelo menos suficiente para neutralizar 100 ng ml−1 CCL21 ou CCL19, conforme determinado em experiências preliminares. As células foram autorizadas a transmigrar durante 3 h a 37 °C numa incubadora., Células que haviam migrado para os poços inferiores foram enumeradas por citometria de fluxo, com células fluorescentes A20 de números conhecidos adicionados imediatamente antes da leitura como um padrão de contagem interna. Cada condição foi medida em poços triplicados, salvo indicação em contrário.
Bioquímicos fracionamento
a Cromatografia foi realizada utilizando um ÄKTApurifer 10 fast protein liquid chromatography (FPLC) system (GE Healthcare), a 4 °C, com exceção da última etapa, que foi realizada utilizando um ÄKTAmicro sistema FPLC (GE Healthcare)., Foi aplicado um total de 1200 ml de meio condicionado ao estroma porcino a uma coluna de permuta de aniões (volume de leito de 250 ml) equilibrada com tampão I (Hepes de 25 mM, pH 7, 0). A coluna foi lavada com três volumes de coluna antes de ser eluída com três volumes de coluna de tampão I complementados com 1 m NaCl. A passagem do fluxo foi alterada com o tampão II (Tris-HCl de 25 mM, pH 8.5) em 100 ml e reaplicada para uma coluna de troca de aniões equilibrada com o tampão II. a coluna foi lavada com dois volumes de coluna de tampão II e eluida com dois volumes de coluna de um gradiente de NaCl linear de 0,1-0,5 m., Foram recolhidas fracções de 10 ml cada, tendo as alíquotas sido alteradas com RPMI 1640 para o ensaio de transwell. As fracções activas foram agrupadas e o tampão transformado em 10 ml com o tampão II e carregado numa coluna de heparina (volume de cama de 5 ml) equilibrado com o tampão II. lavou-se a coluna com 12 volumes de tampão II e eluiu-se com 4 volumes de coluna de gradiente NaCl linear de 0-2 M. Colheram-se fracções de 2 ml cada uma, tendo as alíquotas sido alteradas com a RPMI 1640 para o ensaio de transwell. As fracções activas foram novamente agrupadas e o buffer alterado para 0.,5 ml de tampão de eu e carregados em um Superdex-75 coluna (24 ml de cama volume) equilibrada com tampão I. A coluna foi então eluídas com uma coluna de volume de tampão I. Frações de 0,5 ml cada, foram coletados e alíquotas foram buffer-alterado com RPMI 1640 para o transwell ensaio. As fracções activas foram agrupadas e concentradas em 0, 5 ml para carregar numa coluna Mono S (1 ml de volume de leito) equilibradas com tampão I. lavou-se a coluna com 12 volumes de tampão I e eluiu-se com 25 volumes de coluna de gradiente NaCl linear 0-0, 5 M., Foram recolhidas fracções de 1 ml cada, tendo as alíquotas sido alteradas com RPMI 1640 para o ensaio de transwell. As fracções activas foram agrupadas, alteradas pelo tampão e concentradas em 50 µl com o tampão I e carregadas na coluna Mono S equilibradas com o tampão I. A coluna foi lavada com três volumes de coluna de tampão I contendo 0,3 m NaCl e eluida com 24 volumes de coluna de gradiente NaCl linear de 0,3–0,4 m., Foram recolhidas fracções de 1 ml cada, tendo as alíquotas sido alteradas com RPMI 1640 para o ensaio final de transwell, a fim de identificar a fracção que continha a actividade quimioatractante mais forte.as fracções da última fase de purificação foram concentradas em 50 µl e analisadas em 12% de géis NuPAGE (Invitrogen). Géis foram manchados com a mancha de prata Pierce para a espectrometria de massa (termo Fisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante., As bandas de intensidades aumentadas na fracção que contém a actividade quimioatractante mais forte foram excisadas e submetidas a digestão em gel antes de serem analisadas com um espectrómetro de massa Q exigente em HF (Thermo Fisher Scientific). Os dados da espectrometria de massa foram analisados utilizando a base de dados Swisssprot com o motor de busca mascote.a sequência de codificação do ccl21 do rato foi amplificada a partir do cDNA C57BL/6 do baço do Ratinho e clonada entre os locais de NdeI e XhoI do vector de expressão pET22b+ (Novagen), que fornece uma marca C-terminal., A proteína recombinante foi expressa em ratos BL21(DE3) e purificada pela sua etiqueta. A pureza e a concentração das proteínas foram avaliadas, respectivamente, pelo ensaio SDS–PAGE e BCA, e a bioactividade foi verificada através de um ensaio de mobilização de cálcio. As proteínas recombinantes foram conservadas a -80 °C até à sua utilização. Para medir CCL21 – sua ligação ao GPR174, com CCR7 como um controle positivo, células 293T foram transfectadas com gpr174–GFP ou construções de fusão CCR7–GFP., As alíquotas de células transfectadas foram então incubadas com CCL21–sua proteína em concentrações indicadas a 37 °C durante 30 minutos, lavadas duas vezes com PBS frios, e fixadas imediatamente com 4% de paraformaldeído. Após lavagem em PBS, as células fixas foram manchadas com um anticorpo anti-His conjugado com phycoerythrina (clone J095G46, Biolegend) e analisadas por citometria de fluxo., As células GFP em cada amostra serviram como um controlo interno de coloração de fundo não específico, e a intensidade média de fluorescência (IFM) das células GFP+ manchadas com anticorpo anti-His conjugado com phycoerythrina, com a IFM das células GFP correspondentes subtraídas, foi utilizada para quantificar a ligação ccl21 específica.
A Medição dos fluxos de cálcio desencadeados pela quimioquina
rato Gpr174 e Ccr7 foram amplificados pela PCR e clonados no plasmídeo pRK5. As células HEK293T foram transferidas transitoriamente com plasmídeo gpr174 expressando, expressando CCR7 ou controlando., As células foram separadas fisicamente do recipiente de cultura 48 h após a transfecção, lavadas duas vezes com PBS, e manchadas com 1 µM Indo-1 (Invitrogen) em PBS a 37 °C durante 30 minutos. Após serem lavadas duas vezes com PBS, as células foram ressuspendidas com a solução salina equilibrada de Hanks (Invitrogen) contendo 25 mM de Hepes e 1% de FBS, e mantidas no gelo. Quando submetidas a estimulação quimiocina, as células foram primeiro levadas para um lote de água a 37 °C durante 5 minutos de incubação, e depois avaliadas num citómetro LSR II (Biociências BD) para estabelecer a linha de base para o estado não estimulado., As células foram estimuladas com uma série de concentrações de ccl21 recombinante variando de 0, 1 ng ml−1 a 10 µg ml−1. As células em cada condição foram continuamente monitorizadas e registadas durante 2 minutos. No final, a ionomicina (Sigma) foi adicionada à amostra numa concentração final de 1 µg ml−1, tendo a amostra sido monitorizada e registada durante 1 minuto. Foram utilizadas razões Indo-1(ligado)/Indo-1 (livre) para indicar concentrações intracelulares Ca2+, tal como analisadas no FlowJo (TreeStar). A concentração mais elevada de Ca2+ estimulada pela ionomicina foi utilizada como 100% para normalizar a resposta ao cálcio induzida por CCL21., A CE50 foi estimada em GraphPad através da instalação de uma curva de resposta dose-resposta não linear de três parâmetros.
Imunoprecipitação e western blotting
Recentemente isolados de rato de células B de GPR174–GFP BAC ratos transgênicos foram ativados com 10 µg ml−1 F(ab’)2 de cabra anti-mouse IgM e 10 µg ml−1 anti-CD40 por 48 h. Essas células B ativadas, em seguida, foram suspensos em 2 × 107 células por mililitro em meio RPMI contendo 1% FBS, e não tratada ou estimulados com 300 ng ml−1 CCL21 a 37 °C por 30 min. As células B foram então imediatamente lisadas em 1% de tampão de lise NP-40 (Tris-HCl 25 mM, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glicerol e inibidores da protease). Para a imunoprecipitação do GPPR174 marcado com GFP, os lisados de 108 células B foram incubados de um dia para o outro com 20 µl de contas GFP–Trap (ChromoTek). Após lavagem repetida, os imunoprecipitados foram eluídos por incubação em tampão glicina 0, 2 M (pH 3, 0) durante 10 minutos à temperatura ambiente, e depois neutralizados com 1 m Tris-HCl (pH 8, 5). As proteínas foram separadas pela SDS–PAGE e transferidas para a membrana de polivinilideno (Millipore). As membranas foram bloqueadas com solução salina com tampão Tris contendo 5% de ASC e 0, 1% de Tween 20., Para detectar moléculas-alvo através da imunoblotting, usamos anticorpos anti-GFP de coelho (Abcam), anti-Gai-1 de coelho (Abcam), anti-Gai-2 de coelho (Abcam) e anti-Ga13 de coelho (Abcam). O anticorpo anti-coelho da cabra conjugado com HRP foi comprado à Bioeasytech. Os imunoblots foram detectados usando quimioluminescência melhorada (Thermo Fisher Scientific), e as imagens foram analisadas com software ImageJ.
as células PCR quantitativas
as células dos tipos desejados foram ordenadas com uma FACSAria III e submetidas à extracção total de ARN com o RNeasy mais Mini ou micro kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante., O RNA foi transcrito ao contrário com o MasterMix de RT All-In-One (Abm). A PCR quantitativa foi realizada com qPCR MasterMix (Abm) em um sistema de PCR em tempo Real (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., A expressão relativa dos genes-alvo entre diferentes amostras foi comparada após a normalização contra a expressão dos genes de limpeza Actb ou Gapdh.
Análise de dados estatísticos
estatísticas e gráficos foram conduzidos em Prism (Graphpad). Salvo indicação em contrário, foram utilizados testes T do aluno de duas caudas não emparelhados para comparar os parâmetros de avaliação final de diferentes grupos.
resumo dos relatórios
informações adicionais sobre a concepção da investigação estão disponíveis no resumo dos relatórios da investigação sobre a natureza relacionado com este artigo.