What Is Sanger Sequencing?o sequenciamento de Sanger, também conhecido como “método de terminação de cadeia”, foi desenvolvido pelo bioquímico Inglês Frederick Sanger e seus colegas em 1977. Este método é projetado para determinar a sequência de bases nucleotídicas em um pedaço de DNA (geralmente menos de 1.000 bp de comprimento). Sequência de Sanger com 99.,A precisão de base de 99% é considerada o “padrão-ouro” para a validação de sequências de DNA, incluindo as já sequenciadas através da sequenciação de próxima geração (NGS). A sequenciação de Sanger foi usada no Projeto Genoma Humano para determinar as sequências de fragmentos relativamente pequenos de DNA humano (900 bp ou menos). Estes fragmentos foram usados para reunir fragmentos de ADN maiores e, eventualmente, cromossomas inteiros.sequenciamento de Sanger VS NGS o desenvolvimento de tecnologias NGS acelerou a investigação genómica. NGS pode simultaneamente sequenciar mais de 100 genes e genomas inteiros com DNA de baixa entrada., A sequenciação de Sanger permanece amplamente utilizada no campo de sequenciação, pois oferece várias vantagens proeminentes: (i) custo-eficiência para sequenciamento de genes únicos e (ii) precisão de 99.99%, especialmente adequada para a sequenciação de verificação para mutagênese no local ou inserções clonadas.como funciona a sequenciação de Sanger?
na sequenciação de Sanger, um iniciador de DNA complementar ao DNA modelo (o DNA a ser sequenciado) é usado para ser um ponto de partida para a síntese de DNA., Na presença dos quatro trifosfatos desoxinucleotídicos (dNTPs: a, G, C E T), a polimerase estende o iniciador adicionando o dNTP complementar à cadeia de DNA modelo. Para determinar qual nucleótido é incorporado na cadeia de nucleótidos, quatro trifosfatos de dideoxinucleótidos (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP) rotulados com um corante fluorescente distinto são usados para terminar a reação de síntese. Comparado ao dNTPs, o ddNTPs tem um átomo de oxigênio removido do ribonucleótido, portanto não pode formar uma ligação com o próximo nucleótido., Após síntese, os produtos de reação são carregados em quatro faixas de um único gel, dependendo do nucleótido de cadeia diversa e submetidos à eletroforese em gel. De acordo com seus tamanhos, a sequência do DNA é determinada assim.
Figura 1. A estrutura do ddNTP e dNTP.
Image credit:” Whole-genome sequencing: Figure 1, ” by OpenStax College, Biology)., o método de sequenciação de Sanger consiste em 6 passos: (1) o DNA de cadeia dupla (dsDNA) é desnaturado em dois DNA de cadeia única (ssDNA).
(2) um primer que corresponde a um fim da sequência é anexado.
(3) quatro soluções de polimerase com quatro tipos de dNTPs, mas apenas um tipo de ddNTP são adicionados.
(4) a reação de síntese de DNA inicia e a cadeia se estende até que um nucleótido de terminação é incorporado aleatoriamente.
(5) os fragmentos de DNA resultantes são desnaturados em ssDNA.,
(6) os fragmentos desnaturados são separados por eletroforese em gel e a sequência é determinada.
Figura 2. O método de sequenciação de Sanger em 6 etapas (adaptado de Gauthier 2008).