recentemente, usado CRISPR para interromper o oncogene Kras em duas independente de adenocarcinoma de pulmão de células, linhas , que foram obtidas a partir do Kras G12D; p53 fl/fl (KP) de ratos . Isolámos dois clones unicelulares cada um com remoções de frameshifting em exon 2 (Fig., 1a and Additional file 1: Figure S1a): KP1 carries a 2-nt “-CG” deletion in the G12D allele and a 1-nt “-C” deletion in the otherwise wild-type (WT) Kras allele; and KP2 carries a 2-nt “- GG” deletion. Nenhum clone produz proteína Kras de comprimento completo, indicando que todas as três deleções interrompem a estrutura de leitura Kras.
sgRNA direccionar Kras induz a fuga em clones de células únicas. um esquema de um sgRNA que visa o exon 2 do gene Kras do rato (sgKras)., A ponta vermelha indica o local de clivagem Cas9. As linhas celulares KP1 e KP2 foram transduzidas com lentivírus que codifica Cas9 e sgKras. Two single-cell clones (KP1 clone and KP2 clone) harbor frameshift deletions. Setas pretas indicam as posições dos iniciadores da reação em cadeia da polimerase reversa (RT-PCR). O códon G12D está sublinhado. B normal Kras lê contagens de RNA-sequenciação (RNA-seq) análise de células parentais KP (azul) e clones KP (vermelho). RNA-seq foi feito duas vezes para o clone KP2 e três vezes para os outros grupos. “+”denota WT allele., C RNA-seq mostrando exon 2 parcial saltando em clones KP1. Os números RNA-seq indicam leituras abrangendo as junções exon indicadas. Duas réplicas biológicas representativas são mostradas. d RT-PCR análise de Kras mRNA detecta uma banda exon 2 pulada. Os tamanhos de banda esperados são 331 bp e 209 bp. M, marcador molecular. “*”denota indels in PCR products from clones. o gráfico de dispersão mostra 22 eventos de exon que mudam tanto no KP1 como no KP2 clones. A exclusão de Kras exon 2 é o evento mais frequente., Ψ, percentagem de índice de Splicing
mutações de Frameshift em exons iniciais são conhecidas por despoletar decadência mediada por disparates (NMD) , o que elimina o mRNAs com codões de terminação prematura. Quando analisamos os dados de sequenciação de ARNm (RNA-seq), no entanto, descobrimos que os níveis aparentes de mRNA Kras (ou seja, leituras normalizadas totais de mRNA) só foram reduzidos em 19% nas células KP1 e 47% nas células KP2, em comparação com as células KP parentais (Fig. 1b). Ambos os clones produziram menos leituras exon 2, mas níveis normais de exon 1 e 3 leituras (Fig., 1c), sugerindo que exon 2 pode ser ignorado nos clones KP1 e KP2. Na verdade, detectamos leituras de junção exon 1-3, indicando que exon 2 foi ignorado (Fig. 1C e Ficheiro adicional 1: Figura S1b). Calculando a relação entre as leituras exon 2 e as leituras totais, descobrimos que exon 2 está incluído em apenas 64,0 ± 9,1% das leituras Kras do KP1-clone (Fig. 1c e Quadro 1). Observaram-se saltos de exon 2 semelhantes nos Clones KP2 (ficheiro adicional 1: Figura S1c)., De forma concordante, a transcrição reversa do mRNA Kras seguido de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) produziu dois produtos: um correspondia ao ADN complementar do Kras intacto (cDNA) e o outro correspondia à isoforma 1-3 do exon (Fig. 1d). A isoforma exon 1-3 retém uma estrutura de leitura aberta parcial do Kras que poderia iniciar a tradução de um códon ATG em exon 3 (Arquivo adicional 1: Figura S2) e produzir uma proteína Kras severamente truncada.,
a edição de Kras não induziu splicing alternativo para todo o genoma. Identificamos 97 exons alternativamente ligados em células KP1 e 177 eventos em células KP2. KP1 e KP2 clones compartilharam 22 eventos de inclusão ou exclusão de cassetes, com a exclusão de Kras exon 2 sendo a maior mudança em ambos os clones(Fig. 1E e Ficheiro adicional 1: Quadro S3). Assim, a edição de Kras exon 2 induziu especificamente a fuga de Kras exon 2., Nomeadamente, considerando que o mouse Kras G12D (GGU para GAU) transcrições de não ignorar exão 2 parentais PQ células, descobrimos que cerca de 15% dos humanos KRAS G12S (codão 12 GGU para AGU) transcrições de ignorar éxon 2 do A549 humanos câncer de pulmão de células (linha de arquivo Adicionais 1: Figura S1d). Não fomos capazes de prever o ganho ou perda de intensificadores de splice exon ou silenciadores , mas os nossos dados sugerem que sequências próximas do KRAS codon 12 promovem a inclusão do exon 2 no rato e no Kras humano. Exon saltando induzido pela edição CRISPR não se limitou ao Kras ou às células KP do rato., Um estudo recente mostrou que a edição CRISPR de exon 3 FLOT1 em células HeLa pode causar a ruptura de exon 3, exon 4, ou exons 3, 4 e 5 . Também detectámos exon pouco frequente a saltar quando atingimos exon 11 de LMNA em células humanas HCT116 (ficheiro adicional 1: Figura S3). Saltando LMNA exon 11 produz uma transcrição in-frame que pode ser traduzida em uma proteína neomórfica.
para explorar ainda mais a ideia de que a fuga de exon poderia produzir uma transcrição funcional em frame, perguntámos se a edição mediada por CRISPR do Exon 3 do Ctnnb1 poderia induzir a fuga de exon e causar um fenótipo ganho de função., Exão 3 do Ctnnb1 codifica phosphoacceptor resíduos que promovem a degradação da β-Catenin fator de transcrição ; genética excisão de Ctnnb1 exão 3—o que está no quadro com exão 4—estabiliza a constitutivamente ativa β-Catenin que se acumula no núcleo . Nós projetamos 11 sgRNAs que as regiões-alvo ao longo Ctnnb1 éxon 3 (Ctnnb1-sg1 para -sg11), transformados individuais sgRNAs em KP células, e usado de alta taxa de transferência de seqüenciamento para analisar a extensão da edição, no sgRNA site de destino em cada linha (Fig. 2b eixo dos x, ficheiro adicional 1: Figura S4 e Ficheiro adicional 2: Quadro S4)., Três sgRNAs (sg6, sg9 e sg10) com um alvo insuficiente Ctnnnb1. Oito dos sgRNAs Ctnnb1 (sg1 a sg5, sg7, sg8 e sg11), no entanto, induziram indels nos seus locais-alvo com frequências superiores a 20%. Por exemplo, Ctnnb1-sg1 gerou + t inserções em cerca de 65% das leituras (Fig. 2c). Em cada população visada por um Ctnnb1 sgRNA forte, detectamos três produtos RT-PCR que abrangem exons 2 a 5(Fig. 2d). O produto principal corresponde à transcrição normalmente articulada que inclui o exon 3. Os outros dois produtos correspondem a transcrições alternativamente spliced: um que salta exon 3 (i.e., exon 2-4 splicing, Fig. 2e) e um que salta ambos exons 3 e 4 (Isto é, exon 2-5 splicing, Fig. 2f). Ctnnb1 sgRNAs visando qualquer cadeia de DNA induziu a remoção de exões e a atividade da nuclease Cas9 foi essencial para a remoção de exões (Fig. 3a).
Ctnnb1 sgRNAs segmentação exão 3 induz exão ignorando. um esquema do gene Ctnnb1. O exon 3 in-frame codifica um domínio inibitório: aminoácidos fosforilação 33, 37, 41, e 45 promove a degradação da proteína β-catenina., A perda de exon 3 estabiliza a β-catenina. Onze sgRNAs foram projetados para atingir exon 3: sgRNAs fortes em vermelho e sgRNAs fracas em preto, respectivamente. as sgRNAs que usam” NGG ” PAM são mostradas acima exon 3 e as que usam “CCN” PAM são mostradas abaixo exon 3. B correlação entre a exon 3 saltando e eficiência sgRNA. Os indels genômicos foram medidos por sequenciação profunda. As células KP foram infectadas com lentivírus. Exon 3 eficiências de esquecimento são de (d). Os Indels da sg11 não foram determinados. sgRNAs que induzem > 20% indels são marcados a vermelho., C distribuição dos indels sg1 mostra que a inserção T (+T) no nucleótido Cas9 da clivagem 97 do exon 3 (ponta vermelha da Flecha) foi a mais frequente. A sequência PAM está em azul. d RT-PCR usando iniciadores que abrangem exons 2 e 5 mostra saída parcial exon. M marcador molecular. sgGFP é um sgRNA de controle. Exon 3 skipping bands were quantified using ImageQuant TL software and normalized to full length cDNA bands. a sg4 mostrou bandas fracas visíveis que não puderam ser quantificadas., E, f a clonagem de TOPO e a sequenciação de Sanger confirmaram que as duas maiores bandas de RT-PCR inferiores em (C) são splicing alternativo de exon 2-4 e exon 2-5, respectivamente. g análise Western blot de β-catenina. Β-Catenin de comprimento total é ~86 kD. β-catenina sem exon 3 (delta exon 3) é ~77 kDa. Actina serviu como controle de carregamento
Cas9 nuclease atividade necessária para a omissão de um ou mais exões., a RT-PCR analysis of Ctnnb1 mRNA in KP cells transduced with lentiviruses that encode sgCtnnb1. 2 and nuclease-defective Cas9 (dCas9), dCas9-KRAB fusion, or WT Cas9. A RT-PCR foi realizada utilizando iniciadores em exons 2 e 7 em populações de células KP transduzidas após selecção de puromicina e triagem FACS. O comprimento do exon e a fase de leitura da moldura são mostrados. Apenas o produto de marcação exon 2-4 mantém uma sequência de codificação in-frame β-catenina. b RT-PCR análise do mRNA Ctnnb1 em células KP transdutadas com lentivírus que codificam Cas9 e sgGFP, sg3 ou sg5., “–”não tratadas
Western blot revelou que populações de células transformados com o forte sgRNAs produzem uma menor ~74 kD β-Catenin proteína que corresponde em tamanho do que o esperado do éxon 2 a 4 de emenda do produto (Fig. 2g). A proteína β-catenina de comprimento total não se esgotou significativamente quatro dias após a transdução. Para testar se o splicing alternativo é dependente da contínua expressão de Cas9 ou sgRNA no lentivirus vetores, nós co-transfected Cas9 e Ctnnb1-sg1, ou não, de segmentação sgRNA de controle., Sete dias após a transfecção, quando a transfusão Cas9 e o guia RNAs devem ser esgotados, examinamos a localização Da β-catenina por imunofluorescência. Nas células de fibroblastos do rato transfectadas com um controlo sgRNA não direccionado, a β-catenina localizada em junções celulares (ficheiro adicional 1: Figura S5a). Em contraste, em muitas células transfectadas com Ctnnb1-sg1, detectamos β-catenina no núcleo (arquivo adicional 1: Figura S5a)., Estes resultados sugerem que a edição contínua não é necessária para o salto exon e que o salto exon 3 induzido pela edição mediada por CRISPR do Ctnnb1 exon 3 produz uma isoforma de ganho de função β-catenina.
analisamos transcrições que abrangem exons 2 a 7 em populações de células tratadas com Ctnnb1-sg2, -sg3, e-sg5. Além do full-length isoforma, detectaram-se quatro transcrições com éxon 2, aparentemente, emendados para cada jusante exão (i.e. exão 2-4, exão 2-5, exão 2 a 6, e exão 2-7; Fig. 3a, b)., Nós não entendemos o mecanismo deste aparentemente promíscuo exon saltando induzido pela edição Ctnnb1 exon 3, nem temos sido capazes de correlacionar o exon promíscuo saltando com locais alvo específicos ou mutações indel em exon 3. No entanto, isolamos um clone Ctnnb1-sg3 editado que sugere um mecanismo potencial (ficheiro adicional 1: Figura S6a). Este clone bialélico contém uma deleção de 3-bp em frame em um alelo e uma grande deleção de 832-bp no outro; a deleção de 832-bp funde a extremidade 5′ do intron 2 para a extremidade 3′ do exon 4 (Arquivo adicional 1: Figura S6)., Detectámos duas transcrições nestas células: a transcrição devidamente articulada que inclui a eliminação de 3-bp e uma transcrição que inclui a intron 2 fundida a exon 4 (ficheiro adicional 1: Figura S6c e Tabela 1). Estes resultados sugerem que a aparente fuga de exons detectada em populações de células editadas poderia refletir rearranjos do genoma que removem exons.dois experimentos sustentam a ideia de que um único sgRNA pode induzir grandes deleções genômicas que removem exons., Por exemplo, isolamos 15 clones de células 3T3 do mouse transitoriamente transfectados com Cas9 e Ctnnb1-sg1, e descobrimos que quatro clones (ou seja, clones 4, 5, 13 e 15) mostraram aparente exon saltando por RT-PCR. A PCR genômica revelou rearranjos do genoma em três desses clones: grandes deleções (>500 bp) e deleções menores (~100 bp) em clones 4 e 15, e grandes inserções em clones 13 e 15 (arquivo adicional 1: Figura S7)., Além disso, depois de direcionar exon 6 de p65/RelA, isolamos um clone bialélico p65 (#15): um alelo abriga uma inserção 1-nt “+A” e os outros abriga uma supressão 2268-bp que remove exons 5, 6 e 7 (arquivo adicional 1: Figura S8a, c–e). In p65 clone # 15, we detected the fully spliced transcript and an exon 4-8 splice product (Additional file 1: Figure S8c). Ambos os alelos codificam transcrições frameshifted e ambas as transcrições p65 estão presentes em níveis mais baixos do que WT (ficheiro adicional 1: Figura S8b)., Nós também isolamos um clone P65 editado (#31) homozigous para o mesmo + uma inserção como no clone #15, mas o clone # 31 não produz alternativamente transcrições splicadas. Thus, the exon 4-8 spliced transcript in clone # 15 results from the deletion of exons 5, 6, and 7. Estes grandes eventos de eliminação de exon foram inesperados e seriam perdidos usando testes de triagem baseados em PCR típicos.,
a capacidade de causar uma actividade de ganho de função induzindo exon saltando ou excisão exon sugeriu que a edição meditada CRISPR usando um único sgRNA pode ser uma forma útil para salvar parcialmente a função de um gene de doença que requer resgate de baixo nível. A reparação homóloga do ADN mediada pela CRISPR tem sido usada para corrigir as mutações de codões prematuros no gene Dmd num modelo de DMD no rato e vários grupos têm usado CRISPR para eliminar exões de Dmd e restaurar parcialmente a expressão de Dmd . Nós projetamos quatro lentivírus sgRNA / Cas9 que visam diferentes locais no exon 23 do gene Dmd (Fig., 4a, b) e mioblastos C2C12 transdutores, uma linha celular amplamente utilizada como modelo para distrofia muscular Duchenne (DMD). Em células c2c12 transdutadas com Dmd sgRNAs, detectámos um produto RT-PCR que corresponde ao produto splice normal contendo exon 23. Sequenciando estes produtos RT-PCR revelou que apenas Dmd-sg2 eficientemente editado Dmd exon 23, como evidenciado por picos de sequência mista para além do local alvo sgRNA (ficheiro adicional 1: Figura S9). Em células transduzidas com Dmd-sg2, detectámos também um produto RT-PCR correspondente a exon 22, ligado a exon 24(Fig. 4c, d)., Assim, atingir o exon 23 com um sgRNA pode ser suficiente para induzir a fuga parcial de exon e produzir uma estrutura de leitura aberta de distrofina intacta. DMD é um exemplo clássico de uma doença na qual uma pequena quantidade de restauração funcional pode proporcionar um benefício clínico substancial .
Um sgRNA segmentação exão 23 de Dmd pode restaurar parcialmente no quadro “distrofina” mRNA. a Schematic of sgRNA targeting and skipping of mouse Dmd exon 23 and location of primers for RT-PCR analysis., Saltar da exon 23 irá gerar mRNA in-frame. B sítios-alvo da sgRNA em Dmd exon 23. c análise RT-PCR das células mioblastas do rato c2c12 transdutadas com lentivírus que codificam Cas9 e sgDmd1, 2, 3 ou 4. Os tamanhos de banda esperados são 353 bp e 140 bp. M marcador molecular. d A análise de sequência da banda cDNA de 140 bp a partir de células tratadas com sgDmd2 confirmou splicing de exon 22 a exon 24