Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174-deficit de soareci au fost generate de standard gene-vizează procedurile pentru a înlocui Gpr174 open reading frame cu un LacZ/neo casetă folosind 129SvEvBrd celule stem embrionare linie (Texas Un&M Institutul de Medicina Genomică, TG0128). Acești șoareci cu deficit de GPR174 au fost retrocedați la șoareci C57BL / 6 timp de 12 generații. Relevante soareci pe C57BL/6 de fundal-au încrucișat pentru a obține GFP-exprimarea MD4 șoareci și dsRed-exprimarea GPR174-suficiente sau deficitare MD4 șoareci., Pentru experimente s-au folosit littermates cu vârsta cuprinsă între 6 și 12 săptămâni și dintre sexele indicate. Dimensiunile eșantioanelor pentru experimentele de șoarece au fost determinate empiric, iar șoarecii au fost repartizați aleatoriu la grupul de control sau experimental. Nu a fost necesară orbirea pentru experimentele de șoarece prezentate aici. Toți șoarecii au fost menținuți în condiții specifice fără agenți patogeni și au fost utilizați în conformitate cu orientările guvernamentale și Tsinghua instituțional privind îngrijirea și utilizarea animalelor pentru bunăstarea animalelor.,
GPR174–GFP BAC șoareci transgenici
Secvențe de codificare pentru glicină–glicină–glicină–serină (GGGS) linker (repetat de patru ori) și îmbunătățită GFP (EGFP) au fost introduse imediat înainte de codonul stop al GPR174 cadrul de citire deschis în mouse-ul BAC clona RP23-206J14 prin recombinarea omologă. BAC modificat a fost purificat și microinjectat în pronuclei ovulelor fertilizate pentru a genera reporteri transgenici. Un mouse fondator care a fost testat pozitiv pentru celulele B care exprimă GFP în sânge a fost utilizat pentru a crește în continuare cu șoareci B6 pentru a stabili tulpina BAC GPR174-GFP.,
culturi de Celule, retrovirus și in vitro transducție
Naiv celule T sau B, celulele au fost izolate folosind Negativ CD4 T-celule de Izolare Kit sau Naiv B-celulă de Izolare Kit (Miltenyi Biotec) conform producătorului protocoale. Pentru a exprimă țintă gene în celulele B, purificat celulele B au fost activate cu 1 µg ml−1 lipopolysaccharide (Sigma) pentru 1 zi înainte de a fi spin-infectate cu retrovirale supernatantele la 1500 g pentru 2 sec, ca described18.
construcția chimaerelor măduvei osoase
șoarecii receptori B6 au fost iradiați letal prin raze X (5.,5 Gy, de două ori) și apoi dat un intravenoasă de transfer de 3 × 106 sex cu potrivire de măduvă osoasă de celule, format din 80% µMT celule și 20% GPR174-suficiente sau cu deficit de celule. Chimaerele au fost folosite pentru experimente la șase până la opt săptămâni după reconstituire.șoarecii după înțărcare au fost anesteziați cu avertin (2, 5%, 0, 015 ml greutate corporală g−1) intraperitoneal. Pentru ovariectomia șoarecilor femele, ovarele de pe ambele părți au fost expuse și îndepărtate prin incizii dorsale bilaterale., Pentru orhidectomia la șoarecii masculi, a fost făcută o incizie abdominală mediană pentru a expune și îndepărta testiculele de pe ambele părți. Șoarecii de control operați în mod fals au fost supuși unei intervenții chirurgicale, incluzând incizii dorsale bilaterale sau o incizie abdominală mediană fără îndepărtarea ovarelor sau testiculelor. Deschiderile chirurgicale ale plăgilor au fost suturate, iar antibioticele și analgezicele au fost aplicate local. Șoarecii au fost lăsați să se recupereze timp de opt săptămâni înainte de experimentele ulterioare.,șoarecii în vârstă de șase până la opt săptămâni au fost injectați subcutanat cu testosteron (10 mg kg – 1 greutate corporală) dizolvați în ulei de semințe de floarea soarelui o dată la două zile timp de două săptămâni. Șoarecii de control ai vehiculelor au fost tratați numai cu ulei de semințe de floarea-soarelui.pentru a măsura formarea Centrului germinal de către celulele B MD4, 105 celule T OT-II și 5 × 105 celule B MD4 ale genotipurilor indicate au fost transferate intravenos la destinatarii B6 masculi, care au fost ulterior imunizați subcutanat cu 0.,5 µg lipopolizaharidă și 30 µg hel–ovule conjugate antigen în alum (termo științific). La HEL–OVA a fost făcută de către chimice de reticulare cu un HydraLink conjugare kit (SoluLink) anterior described19. Pentru a măsura germinal-centru de formare, ca răspuns la CCSB imunizare sau virusul coriomeningitei limfocitare (LCMV) infecție, șoarecilor li s-a injectat intraperitoneal cu 5 × 108 SRBCs (de la Z. Baiji) sau 2 × 105 unități formatoare de LCMV Armstrong virus (de la L. Ye și R. Ahmed).,
EAE de MOG proteine imunizare
secvența de codificare primele 120 de aminoacizi umane MOG a fost amplificat prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) de la un creier uman ADN complementar bibliotecă, și clonate între NdeI și XhoI site-uri de pET22b+ exprimarea vectorială (Novagen). Proteina MOG umană a fost exprimată în Escherichia coli BL21(de3) și purificată prin eticheta sa carboxi-terminală histidină (His). Puritatea și concentrația proteinei au fost evaluate prin testul proteic SDS–PAGE și, respectiv, acidul bicinchoninic (BCA). Proteinele recombinante au fost păstrate la -80 °C până la utilizare., Pentru a induce EAE, animalele himerice din măduva osoasă din tipurile indicate au fost imunizate subcutanat la flanc cu 200 µg proteină MOG umană recombinantă emulsionată în adjuvantul complet al lui Freund în ziua 0. Șoarecii au fost injectați intravenos cu 200 ng de toxină pertussis (Invitrogen) în zilele 0 și 2. Șoarecii au fost monitorizați zilnic în mod orb pentru progresia bolii începând cu Ziua 1. Severitatea bolii a fost marcată după cum urmează: 0, fără semne clinice; 1, coada paralizată; 2, pierderea mișcării coordonate și pareza membrelor posterioare; 2,5, paralizia unui membru posterior; 3, paralizia ambelor membre posterioare; 3.,5, paralizia ambelor membre posterioare și slăbiciune în membrele anterioare; 4, paralizia membrelor anterioare; și 5, muribund. Pentru a compara severitatea bolii, am studiat zece șoareci per condiție per experiment și am analizat scorurile bolii de-a lungul timpului cu ANOVA bidirecțională.
citometrie în Flux
Măsurarea antigen-specifice titruri de anticorpi
Pentru a măsura CCSB specifice titruri de anticorpi, ne-lizate 5 × 108 SRBCs cu 1 ml dublu-apă distilată și se centrifughează le la 15.000 r.p.m. pentru 20 min., Pilula a fost resuspendat în PBS și folosit pentru a acoperi MaxiSorp enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plăci (Nunc Maxisorp) peste noapte la 4 °C. Pentru a măsura MOG specifice serice de anticorpi, ne-am folosit de 2 µg ml−1 purificat uman recombinant MOG pentru a acoperi plăcile ELISA. Legarea nespecifică a fost blocată cu albumină serică bovină 1% (BSA) în PBS cu Tween-20 (PBST) timp de 2 ore la 37 °C, urmată de incubare cu diluții seriale 2× ale probelor serice de șoareci imunizați timp de 1 oră la 37 °C., Plăcile au fost spălate și incubate cu peroxidază de hrean (HRP)-anticorp secundar conjugat anti-șoarece IgG (1/20,000) timp de 1 h la 37 °C. plăcile au fost spălate, dezvoltate cu 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidină (TMB) și oprite cu 1 m HCl. Am setat puțurile goale ca zero și am înregistrat absorbanța la 450 nm. Am folosit seruri de la șoareci neimunizați ca control negativ; valoarea limită a fost densitatea optică la 450 nm (OD450) a controlului negativ înmulțită cu 2.1. Un puț cu o valoare OD450 de cel puțin valoarea limită a fost considerat pozitiv., Cea mai mare diluție a unui eșantion care a dat pozitivitate este titrul eșantionului.
de Distribuție a celulelor B prin imunohistochimie
Pentru diverse experimente, naiv celulele B, celulele B activate timp de 1 h, cu 10 µg ml−1 F(ab’)2 capră anti-mouse-ul IgM (Jackson Immunoresearch), sau celule B transduced cu retrovirus au fost transferate într-B6 destinatari. Atunci când este necesar, aceste celule au fost etichetate cu 1 µM tetramethylrhodamine (TAMRA), 4-clorometil-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin (CMF2HC) sau 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) (Invitrogen)., Splina sau ganglionilor limfatici inghinali de destinatar șoareci au fost fixate cu 1% paraformaldehidă pentru 12 h și apoi deshidratat la 30% zaharoză soluție pentru 12 ore la 4 °C. Pentru a asigura maximum de reprezentare a diferitelor organe regiuni în setul final de date, prelucrate neconsecutive secțiuni de țesut și colorează-le cu indicat anticorpi. Reactivi de colorare incluse eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), iepure anti-GFP (abcam), și AF488 capra anti-IgG de iepure (Invitrogen)., Lamelele au fost montate cu reactivul Antifade ProlongGold (Invitrogen) și examinate cu un microscop vertical Olympus FV1000. Imaginile au fost analizate cu Imaris (Bitplane) și ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
prepararea stromei splenice
splinele de la șoareci, șobolani sau porci au fost presate și măcinate în mod repetat pe o plasă metalică pentru a elibera globulele roșii și limfocitele. Restul unsuspendable, amorfă stromale elemente de țesut au fost bine spălate cu PBS înainte de a fi introduse în B27 ser-gratuit mediu de cultură (Invitrogen) și incubate la 37 °C timp de 12 sec., Pentru șoareci, elementele stromale de la trei animale au fost cultivate în mediu de 1 ml. Pentru porci, elementele stromale din 1 splină au fost cultivate în 80 ml. Cultura rezultată a fost centrifugată la 10.000 RPM timp de 60 min pentru a obține mediul condiționat, care a fost fie utilizat imediat pentru experimente, fie congelat la -20 °C până la utilizare.
Transwell test
celulele B activate cu 1 µg ml−1 lipopolysaccharide pentru 60 sec au fost folosite pentru a analiza diferite fracțiuni rezultate din biochimice fracționare., B Naive celule sau celulele B activate cu 10 µg ml−1 F(ab’)2 capră anti-mouse-ul IgM (Jackson Immunoresearch) și 10 µg ml−1 anti-CD40 (clona FGK4.5, Bio X Celule) au fost utilizate pentru a analiza CCL21 induse de migrație. Atunci când celulele B ale diferitelor genotipuri s-au comparat, de cel puțin trei donator șoareci de fiecare genotip și tratament au fost folosite pentru a izola celulele B în fiecare experiment, și puii s-au folosit întotdeauna. Celulele B au fost suspendate la 106 celule pe mililitru și odihnite în mediu RPMI conținând 1% FBS la 37 °C timp de 1 oră., Apoi s-a adăugat o suspensie celulară de 100 µl în camera superioară într-un Transwell cu pori de 5 µm (Corning Costar) și un total de 150 µl soluții conținând atractant au fost adăugate în camera inferioară. Aceste soluții sunt incluse mediu de cultură condiționat brut cu mouse-ul splenic stroma pregătire, mediu de cultură condiționat, cu brute porcine splenică stroma pregătire, de eluție fracțiuni de cromatografie, mediu de cultură conținând recombinant CCL21 și CCL19 (Peprotech), sau 18/0 LysoPS (Avanti Polar Lipids) de concentrațiile indicate., Pentru unele experimente, murin stroma condiționat mediu a fost prima completată cu o concentrație finală de 5 µg ml−1 anticorpi neutralizanți împotriva mouse-ul CCL21 sau CCL19 (R&D de sistem) sau de capră izotip IgG control, și se incubează la temperatura de 4 °C timp de 3 h înainte de a fi utilizate pentru transwell testului. Anticorpi doza a fost de cel puțin suficientă pentru a neutraliza 100 ng ml−1 CCL21 sau CCL19, determinată în experimente preliminare. Celulele au fost lăsate să transmigreze timp de 3 ore la 37 °C într-un incubator., Celulele care au migrat în puțurile de Jos au fost enumerate prin citometrie în flux, cu celule fluorescente A20 cu numere cunoscute adăugate imediat înainte de citire ca standard intern de numărare. Fiecare condiție a fost măsurată în puțuri triplicate, cu excepția cazului în care se indică altfel.
Biochimice fracționarea
Cromatografică a fost efectuată folosind un ÄKTApurifer 10 rapid proteinelor cromatografia de lichide (FPLC) sistem (GE Healthcare), la 4 °C, cu excepția ultimului pas, care a fost efectuat folosind un ÄKTAmicro FPLC sistem (GE Healthcare)., Un total de 1,200 ml mediu condiționat de stroma porcină a fost aplicat pe o coloană de schimb de anioni (250 ml volum pat) echilibrat cu tampon I (25 mm Hepes, pH 7.0). Coloana a fost spălată cu trei volume de coloane înainte de a fi eluată cu trei volume de coloane de tampon i completate cu 1 M NaCl. Fluxul a fost buffer-a schimbat cu tampon a II-a (25 mM Tris-HCl, pH 8.5) în 100 ml și se repun la un anion-coloană de schimb echilibrat cu tampon II. Coloana a fost spălat cu două coloane volume de tampon II și eluat cu două coloane volume de 0,1–0,5 M linear gradient de NaCl., Au fost colectate fracțiuni de câte 10 ml fiecare, iar alicotele au fost schimbate tampon cu RPMI 1640 pentru testul transwell. Active fracțiuni au fost reunite și buffer-a schimbat în 10 ml cu tampon II și încărcate într-un heparina coloana (5 ml pat volum) echilibrat cu tampon II. Coloana a fost spălat cu 12 coloana volume de tampon II și eluat cu 4 coloana volume de 0-2 M linear gradient de NaCl. Fracțiuni de 2 ml fiecare, au fost colectate și alicote au fost buffer-a schimbat cu RPMI 1640 pentru transwell testului. Fracțiile Active au fost din nou grupate, tampon-schimbat în 0.,5 ml tampon-am și încărcat pe un Superdex-75 coloana (24 ml pat volum) echilibrat cu tampon I. coloana A fost apoi eluate cu o coloană de volum de soluție tampon I. Fracțiuni de 0,5 ml fiecare, au fost colectate, și alicote au fost buffer-a schimbat cu RPMI 1640 pentru transwell testului. Fracțiunile Active au fost grupate și concentrate în 0,5 ml pentru a se încărca pe o coloană Mono s (volum de pat de 1 ml) echilibrat cu tampon I. coloana a fost spălată cu 12 volume de coloană de tampon I și eluată cu 25 volume de coloană de 0-0, 5 m gradient liniar de NaCl., Au fost colectate fracțiuni de câte 1 ml fiecare, iar alicotele au fost schimbate tampon cu RPMI 1640 pentru testul transwell. Fracțiile Active au fost grupate, schimbate tampon și concentrate în 50 µl cu tampon I și reîncărcate pe coloana Mono s echilibrată cu tampon I. coloana a fost spălată cu trei volume de coloană de tampon I conținând 0,3 m NaCl și eluată cu 24 volume de coloană de 0,3–0,4 m gradient liniar de NaCl., Fracțiuni de 1 ml fiecare, au fost colectate, și alicote au fost buffer-a schimbat cu RPMI 1640 pentru finala transwell testului de a identifica fracțiune care conținea mai puternic chemoatractant activitate.
analiza spectrometriei de masă
fracțiile din ultima etapă de purificare au fost concentrate în 50 µl și analizate pe geluri NuPAGE 12% (Invitrogen). Gelurile au fost colorate cu pata de argint Pierce pentru spectrometrie de masă (Thermo Fisher Scientific) conform protocolului producătorului., Benzile de crescut intensități în fracțiunea care conține cel mai puternic chemoatractant activitate au fost excizate și supuse într-gel de digestie înainte de a fi analizate cu un Q Exactive HF spectrometru de masă (Thermo Fisher Scientific). Datele de spectrometrie de masă au fost analizate folosind baza de date Swissprot cu motorul de Căutare MASCOT.
Sa-tag-ul recombinant CCL21 și obligatorii test
mouse-ul CCL21 secvența de codificare a fost amplificat de C57BL/6 splină de șoarece adnc și clonate între NdeI și XhoI site-uri de pET22b+ exprimarea vectorială (Novagen), care oferă un C-terminal tag-ul Lui., Proteina recombinantă a fost exprimată în șoareci BL21(de3) și purificată prin eticheta sa. Puritatea și concentrația proteinelor au fost evaluate prin testul SDS–PAGE și, respectiv, BCA, iar bioactivitatea a fost verificată utilizând un test de mobilizare a calciului. Proteinele recombinante au fost păstrate la -80 °C până la utilizare. Pentru a măsura CCL21–Lui legare la GPR174, cu CCR7 ca un control pozitiv, 293T celulele au fost transfectate cu GPR174–GFP sau CCR7–GFP fuziune constructe., Alicotele de celule transfectate au fost apoi incubate cu ccl21-proteina sa la concentrații indicate la 37 °C timp de 30 min, spălate de două ori cu PBS rece și fixate imediat cu paraformaldehidă 4%. După spălări în PBS, fix celulele au fost colorate cu o ficoeritrină-conjugat anti-Lui de anticorpi (clona J095G46, Biolegend) și analizate prin citometrie în flux., GFP− celule în fiecare probă a servit ca un nespecifice de fundal colorare de control intern, și intensitatea fluorescenței (IFM) din GFP+ celulele colorate cu ficoeritrină-conjugat anti-Lui de anticorpi, cu MFI corespunzătoare GFP− celule scade, a fost folosit pentru a cuantifica specifice CCL21 obligatorii.
de Măsurare de chemokine-a declanșat calciu fluxurilor
Mouse Gpr174 și Ccr7 au fost amplificate prin PCR și clonate în pRK5 plasmidic. Celulele HEK293T au fost transfectate tranzitoriu cu plasmidă care exprimă gpr174, care exprimă ccr7 sau de control., Celulele au fost detașate fizic de vasul de cultură la 48 de ore după transfecție, spălate de două ori cu PBS și colorate cu 1 µM Indo-1 (Invitrogen) în PBS la 37 °C timp de 30 min. După ce au fost spălate de două ori cu PBS, celulele au fost resuspendate cu soluție de sare echilibrată Hanks (Invitrogen) conținând Hepes 25 mM și 1% FBS și ținute pe gheață. Când au fost supuse stimulării chemokinei, celulele au fost introduse mai întâi într-un lot de apă la 37 °C timp de 5 minute de incubare și apoi evaluate pe un Citometru LSR II (BD Biosciences) pentru a stabili valoarea de bază pentru starea nestimulată., Celulele au fost stimulate cu o serie de concentrații de ccl21 recombinant variind între 0,1 ng ml−1 și 10 µg ml−1. Celulele la fiecare afecțiune au fost monitorizate continuu și înregistrate timp de 2 minute. La sfârșit, ionomicina (Sigma) a fost adăugată în continuare la probă la o concentrație finală de 1 µg ml−1, iar proba a fost monitorizată și înregistrată în continuare timp de 1 min. Rapoartele Indo-1(legat)/Indo-1(liber) au fost utilizate pentru a indica concentrațiile intracelulare de Ca2+, analizate în FlowJo (TreeStar). Cea mai mare concentrație de Ca2+ stimulată de ionomicină a fost utilizată ca 100% pentru a normaliza răspunsul calciului indus de CCL21., CE50 a fost estimat în GraphPad prin montarea unei curbe neliniare doză-răspuns cu trei parametri.
Immunoprecipitation și western blotting
Proaspăt izolate mouse-ul celulele B din GPR174–GFP BAC șoareci transgenici au fost activate cu 10 µg ml−1 F(ab’)2 capră anti-mouse-ul IgM și 10 µg ml−1 anti-CD40 pentru 48 de ore. Aceste activat celulele B au fost apoi suspendată la 2 × 107 celule / ml în mediu RPMI cu 1% FBS, și este lasata netratata sau stimulat cu 300 ng ml−1 CCL21 la 37 °C timp de 30 min. Celulele B au fost apoi imediat lizate în tampon de liză 1% NP-40 (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glicerol și inhibitori de protează). Pentru immunoprecipitation de GFP-a etichetat GPR174, lysates de 108 B, celulele au fost incubate peste noapte cu 20 µl de GFP–Capcană margele (ChromoTek). După spălări repetate, imunoprecipitele au fost eluate prin incubare în tampon de glicină 0,2 M (pH 3,0) timp de 10 min la temperatura camerei și apoi neutralizate cu 1 m Tris-HCl (pH 8,5). Proteinele au fost separate prin SDS-PAGE și transferate în membrana poliviniliden (Millipore). Membranele au fost blocate cu soluție salină tamponată cu Tris conținând 5% BSA și 0,1% Tween 20., Pentru a detecta moleculele țintă imunoblot, ne-am folosit de iepure anti-GFP (Abcam), iepure anti-Gai-1 (Abcam), iepure anti-Gai-2 (Abcam) și de iepure anti-Ga13 (Abcam) anticorpi. Anticorpul anti-iepure de capră conjugat HRP a fost achiziționat de la Bioeasytech. Imunobloturile au fost detectate folosind chemiluminescența îmbunătățită (Thermo Fisher Scientific), iar imaginile au fost analizate cu software-ul ImageJ.
PCR cantitativ
celulele de tipuri dorite au fost sortate cu un FACSAria III și supuse extracției totale de ARN cu RNeasy Plus Mini sau Micro kit (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului., ARN-ul a fost transcris invers cu RT MasterMix (Abm) All-In-One. PCR cantitativ a fost efectuat cu qPCR MasterMix (Abm) pe un sistem PCR în timp real 7500 (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., Expresia relativă a genelor țintă între diferite probe a fost comparată după normalizarea împotriva expresiei genelor de menaj Actb sau Gapdh.
analiza datelor statistice
Statisticile și graficele au fost efectuate în Prism (Graphpad). Cu excepția cazului în care se indică altfel, testele T ale studenților nepereche cu două cozi au fost utilizate pentru a compara mijloacele punctului final ale diferitelor grupuri.
Rezumatul raportării
informații suplimentare despre proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul raportării cercetării naturii legat de această lucrare.