ce este Sanger Sequencing?secvențierea Sanger, cunoscută și sub numele de” metoda de terminare a lanțului”, a fost dezvoltată de biochimistul englez Frederick Sanger și colegii săi în 1977. Această metodă este concepută pentru determinarea secvenței bazelor nucleotidice dintr-o bucată de ADN (de obicei mai mică de 1.000 bp în lungime). Sanger secvențiere cu 99.,Precizia de bază de 99% este considerată „standardul de aur” pentru validarea secvențelor ADN, inclusiv a celor deja secvențiate prin secvențiere de generație următoare (NGS). Secvențierea Sanger a fost utilizată în Proiectul genomului uman pentru a determina secvențele de fragmente relativ mici de ADN uman (900 bp sau mai puțin). Aceste fragmente au fost folosite pentru a asambla fragmente de ADN mai mari și, în cele din urmă, cromozomi întregi.dezvoltarea tehnologiilor NGS a accelerat cercetarea genomică. NGS poate secvența simultan mai mult de 100 de gene și genomi întregi cu ADN cu intrare scăzută., Secvențierea Sanger rămâne utilizată pe scară largă în câmpul de secvențiere, deoarece oferă mai multe avantaje proeminente: (i) cost-eficiență pentru secvențierea genelor unice și (ii) precizie de 99,99%, potrivită în special pentru secvențierea verificării mutagenezei sau inserțiilor clonate.cum funcționează secvențierea Sanger?
în secvențierea Sanger, un primer ADN complementar ADN-ului șablon (ADN-ul care urmează să fie secvențiat) este folosit pentru a fi un punct de plecare pentru sinteza ADN-ului., În prezența celor patru trifosfați de deoxinucleotide (dNTPs: A, G, C și T), polimeraza extinde primerul prin adăugarea dNTP complementară la catena ADN șablon. Pentru a determina care nucleotidelor este încorporată în lanțul de nucleotide, patru dideoxynucleotide trifosfați (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, și ddTTP) etichetate cu un distinct colorant fluorescent sunt folosite pentru a rezilia reacție de sinteză. În comparație cu dNTPs, ddNTPs are un atom de oxigen îndepărtat din ribonucleotidă, prin urmare nu poate forma o legătură cu următoarea nucleotidă., În urma sintezei, produsele de reacție sunt încărcate în patru benzi ale unui singur gel, în funcție de nucleotida care se termină în lanț și sunt supuse electroforezei în gel. În funcție de dimensiunile lor, secvența ADN-ului este astfel determinată.
Figura 1. Structura ddNTP și dNTP.
credit Imagine:” secvențierea întregului genom: Figura 1, ” de OpenStax College, Biologie)., metoda de secvențiere Sanger constă din 6 pași:
(1) ADN-ul dublu catenar (dsDNA) este denaturat în două ADN-uri monocatenare (ssDNA).
(2) este atașat un primer care corespunde unui capăt al secvenței.
(3) se adaugă patru soluții de polimerază cu patru tipuri de dNTPs, dar numai un singur tip de ddNTP.
(4) reacția de sinteză ADN inițiază și lanțul se extinde până când o nucleotidă terminală este încorporată aleatoriu.
(5) fragmentele ADN rezultate sunt denaturate în ssDNA.,
(6) fragmentele denaturate sunt separate prin electroforeză în gel și se determină secvența.
Figura 2. Metoda de secvențiere Sanger în 6 pași (adaptată din Gauthier 2008).