recent Am folosit CRISPR pentru a perturba Kras oncogene în două independente adenocarcinom pulmonar linii de celule , care au fost derivate din Kras G12D; p53 fl/fl (KP) șoareci . Am izolat două clone cu o singură celulă, fiecare purtând ștergeri de frameshifting în exonul 2 (Fig., 1a și Suplimentare de fișiere 1: Figura S1a): KP1 poartă o 2-nt „-CG” ștergerea în G12D alelă și 1-nt „-C” ștergerea în altfel de tip sălbatic (WT) Kras alela; și KP2 poartă o 2-nt „-GG” stergere. Nici o clonă nu produce proteină Kras de lungime completă, ceea ce indică faptul că toate cele trei ștergeri perturbă cadrul de citire Kras.
sgRNA vizează Kras induce ignorarea exonului în celulă clone. o schemă a unui sgrna care vizează exonul 2 al genei Kras de șoarece (sgKras)., Capul de săgeată roșu denotă locul de scindare Cas9. KP1 și KP2 linii celulare au fost transduced cu lentivirus care codifică Cas9 și sgKras. Două clone cu o singură celulă (clona KP1 și clona KP2) port ștergeri frameshift. Săgețile negre indică pozițiile primerilor de reacție în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR). Codonul G12D este subliniat. B Kras normalizat citește numărul din analiza ARN-secvențiere (ARN-seq) a celulelor parentale KP (albastru) și a clonelor KP (roșu). ARN-seq a fost făcut de două ori pentru clona KP2 și de trei ori pentru celelalte grupuri. „+”denotă alela WT., c ARN-seq care prezintă Exon parțial 2 sărind peste în Clone KP1. Numerele ARN-seq indică citirile care acoperă joncțiunile exonice indicate. Sunt prezentate două replici biologice reprezentative. d analiza RT-PCR a ARNm Kras detectează o bandă de Exon 2 omisă. Dimensiunile preconizate ale benzii sunt 331 bp și 209 bp. M, marker molecular. „*”denotă indels în produsele PCR din clone. e Scatter complot care arată 22 de evenimente exon care se schimbă atât în clonele KP1, cât și în cele KP2. Excluderea Kras exon 2 este cel mai frecvent eveniment., Ψ, Indicele de îmbinare procentuală
mutațiile Frameshift în exonii timpurii sunt cunoscute pentru a declanșa dezintegrarea mediată de nonsens (NMD) , care elimină mRNAs cu codoni de terminare prematură. Cu toate acestea, când am analizat datele de secvențiere a ARNm( ARN-seq), am constatat că nivelurile ARNm Kras aparente (adică citirile ARNm normalizate totale) au fost reduse doar cu 19% în celulele KP1 și 47% în celulele KP2, comparativ cu celulele KP parentale (Fig. 1b). Ambele clone au produs mai puține citiri ale exonului 2, dar nivelurile normale ale citirilor exonului 1 și 3 (Fig., 1C), sugerând că exon 2 ar putea fi omis în clonele KP1 și KP2. Într-adevăr, am detectat Exon 1-3 joncțiune citește, indicând faptul că exon 2 a fost omisă (Fig. 1C și fișier suplimentar 1: Figura S1b). Calculând raportul dintre citirile exonului 2 și citirile totale, am constatat că exonul 2 este inclus doar în 64,0 ± 9,1% din citirile Kras din clona KP1 (Fig. 1C și Tabelul 1). Omiterea exonului 2 Similar a fost observată în clonele KP2 (fișier suplimentar 1: Figura S1c)., Ca urmare, revers transcrierea genei Kras arnm, urmată de reacția de polimerizare în lanț (RT-PCR) a cedat două produse: un corespundea intact Kras ADN complementar (adnc) și alte corespundea exonul 1-3 izoenzimei (Fig. 1D). Izoforma exon 1-3 păstrează un cadru de citire Kras parțial deschis care ar putea iniția traducerea dintr-un codon ATG în exon 3 (Fișier suplimentar 1: Figura S2) și produce o proteină Kras sever trunchiată.,
Editare a Kras nu induce alternative de despicare genome-wide. Am identificat 97 de exoni alternativi în celulele KP1 și 177 de evenimente în celulele KP2. Clonele KP1 și KP2 au împărtășit 22 de evenimente de includere sau excludere a casetei, excluderea Kras exon 2 fiind cea mai mare schimbare în ambele clone (Fig. 1E și fișier suplimentar 1: Tabelul S3). Astfel, editarea exonului Kras 2 a indus în mod specific omiterea exonului Kras 2., În special, întrucât mouse-ul Kras G12D (GGU să GAU) transcrieri nu sari peste exonul 2 în parental KP celule, am constatat că ~15% din umană KRAS G12S (codonul 12 GGU să AGU) transcrieri sări exonul 2 în A549 omului cancer pulmonar cu celule de linie (fișier Suplimentar 1: Figura S1d). Nu am putut prezice câștigul sau pierderea amplificatoarelor de îmbinare a exonilor sau a amortizoarelor de zgomot, dar datele noastre sugerează că secvențele din apropierea codonului Kras 12 promovează includerea exonului 2 în Kras de șoarece și uman. Omiterea exonului indusă de editarea CRISPR nu s-a limitat la Kras sau la celulele KP de șoarece., Un studiu recent a arătat că editarea CRISPR a exonului FLOT1 3 în celulele HeLa poate provoca omiterea exonului 3, exonului 4 sau exonilor 3, 4 și 5 . De asemenea, am detectat omiterea exonului rar atunci când am vizat exonul 11 al LMNA în celulele HCT116 umane (fișier suplimentar 1: Figura S3). Omiterea exonului LMNA 11 produce o transcriere în cadru care ar putea fi tradusă într-o proteină neomorfă.
Pentru a explora în continuare ideea că ignorarea exonului ar putea produce un funcțională într-cadru de transcriere, ne-am întrebat dacă CRISPR-mediate prin Ctnnb1 exonul 3 ar putea induce ignorarea exonului și provoca un câștig de funcție de fenotip., Exonul 3 al Ctnnb1 codifică phosphoacceptor reziduuri care promovează degradarea β-Catenin factor de transcriere ; genetică excizia Ctnnb1 exonul 3—care este, în cadru cu exonul 4—stabilizează o constitutiv activă β-Catenin care se acumulează în nucleu . Am proiectat 11 sgRNAs că regiunile-țintă de-a lungul Ctnnb1 exonul 3 (Ctnnb1-sg1 să -sg11), convertirea individuală sgRNAs în KP celule, și utilizate high-throughput de secvențiere a analiza gradul de editare la sgRNA-ul țintă în fiecare linie (Fig. 2B axa x, fișier suplimentar 1: Figura S4 și fișier suplimentar 2: Tabelul S4)., Trei sgRNAs (SG6, sg9 și Sg10) au vizat ineficient Ctnnb1. Opt dintre Ctnnb1 sgRNAs (sg1 să sg5, sg7, sg8, și sg11), cu toate acestea, induse indels la ținta lor site-uri cu frecvențe care a depășit 20%. De exemplu, Ctnnb1-sg1 a generat inserții + T în aproximativ 65% din citiri (Fig. 2c). În fiecare populație vizată de un Sgrna puternic Ctnnb1, am detectat trei produse RT-PCR care acoperă exonii 2 până la 5 (Fig. 2D). Produsul major corespunde transcrierii în mod normal îmbinate care include exon 3. Celelalte două produse corespund transcrierilor îmbinate alternativ: una care omite exon 3 (adică., Exon 2-4 despicare, Fig. 2E) și unul care omite atât exonii 3 cât și 4 (exonul 2-5 despicare, Fig. 2f). Ctnnb1 sgRNAs vizează fie ADN induse ignorarea exonului și Cas9 nuclează activitate a fost esențială pentru ignorarea exonului (Fig. 3a).
Ctnnb1 sgRNAs vizează exonul 3 induce ignorarea exonului. o schemă a genei Ctnnb1. Exonul 3 în cadru codifică un domeniu inhibitor: aminoacizii de fosforilare 33, 37, 41 și 45 promovează degradarea proteinei β-catenină., Pierderea exonului 3 stabilizează β-Catenina. Unsprezece sgRNAs au fost concepute pentru a viza exonul 3: sgrnas puternic în roșu și sgrnas slab în negru, respectiv. sgrn – urile care utilizează PAM „NGG” sunt prezentate mai sus exon 3, iar cele care utilizează PAM „CCN” sunt prezentate mai jos exon 3. B corelația dintre saltul exonului 3 și eficiența sgRNA. Indelele genomice au fost măsurate prin secvențiere profundă. Celulele PK au fost infectate cu lentivirus. Exon 3 sărind peste eficiențele sunt de la (d). Indel-urile sg11 nu au fost determinate. sgRNAs care induc > 20% indels sunt marcate în roșu., distribuția C a indelelor sg1 arată că cea mai frecventă a fost inserția T (+T) la nucleotida 97 a locului de scindare Cas9 a exonului 3 (capul săgeții roșii). Secvența PAM este în albastru. D RT-PCR folosind primeri care acoperă exoni 2 și 5 arată sărind peste Exon parțială. M marker molecular. sgGFP este un sgrna de control. Benzile de sărituri Exon 3 au fost cuantificate folosind software-ul ImageQuant TL și normalizate la benzile ADNc de lungime completă. sg4 a arătat benzi slabe vizibile care nu au putut fi cuantificate., clonarea TOPO E, F și secvențierea Sanger au confirmat că cele două benzi principale RT-PCR inferioare din (c) sunt îmbinarea alternativă a exonului 2-4 și, respectiv, a exonului 2-5. g analiza Western blot a β-Cateninei. Lungimea totală β-Catenin este ~86 kD. β-Catenina fără exon 3 (delta exon 3) este ~77 kDa. Actina servit ca o încărcare de control
Cas9 nuclează de activitate necesare pentru sărind peste una sau mai multe exoni., un RT-PCR analiza Ctnnb1 arnm în KP celule transduced cu lentiviruses care codifica sgCtnnb1.2 și nuclează-defecte Cas9 (dCas9), dCas9-KRAB de fuziune, sau WT Cas9. RT-PCR a fost efectuat utilizând primeri în exonii 2 și 7 pe populațiile de celule KP transduse după selectarea puromicinei și sortarea FACS. Sunt afișate lungimea exonului și faza cadrului de citire. Numai produsul de îmbinare exon 2-4 păstrează o secvență de codificare β-catenină în cadru. b RT-PCR analiza Ctnnb1 arnm în KP celule transduced cu lentiviruses care codifica Cas9 și sgGFP, sg3, sau sg5., „–”, netratate
Western blot analiza a relevat faptul că populațiile de celule transduced cu puternic sgRNAs produce o mic ~74 kD β-Catenin proteine care corespunde ca dimensiune cu cel așteptat din exonul 2-4 îmbinare produs (Fig. 2G). Proteina β-catenină de lungime întreagă nu a fost epuizată semnificativ la patru zile după transducție. Pentru a testa dacă despicare alternative este dependentă de exprimarea continuă a Cas9 sau sgRNA în vectori lentivirali, am co-transfectate Cas9 și Ctnnb1-sg1 sau un non-direcționare sgRNA de control., La șapte zile după transfecție, când transfectate Cas9 și ghid RNAs ar trebui să fie epuizate, am examinat β-Catenin localizare prin imunofluorescență. În celulele fibroblaste de șoarece transfectate cu un sgrna de control care nu vizează, β-Catenina localizată la joncțiunile celulare (fișier suplimentar 1: Figura S5a). Prin contrast, în multe celule transfectate cu Ctnnb1-sg1, am detectat β-Catenin în nucleu (fișier Suplimentar 1: Figura S5a)., Aceste rezultate sugerează că continuă editarea nu este necesară pentru ignorarea exonului și că exonul 3 sărind peste induse de CRISPR-mediate prin Ctnnb1 exonul 3 produce un câștig de funcție β-Catenin izoenzimei.
am analizat în continuare transcrierile care acoperă exonii 2 până la 7 în populațiile de celule tratate cu Ctnnb1-sg2, -sg3 și-sg5. În plus față de izoformul de lungime întreagă, am detectat patru transcrieri cu exon 2 aparent îmbinate la fiecare exon din aval (exon 2-4, exon 2-5, exon 2-6 și exon 2-7; Fig. 3a, b)., Nu înțelegem mecanismul acestei sărituri aparent promiscue a exonului indusă de editarea Ctnnb1 exon 3 și nici nu am reușit să corelăm săriturile promiscue ale exonului cu site-uri țintă specifice sau mutații indel în exon 3. Cu toate acestea, am izolat o clonă editată Ctnnb1-sg3 care sugerează un mecanism potențial (fișier suplimentar 1: Figura S6a). Această clonă bialelică conține o ștergere în cadru de 3-bp pe o alelă și o ștergere mare de 832-bp pe cealaltă; ștergerea de 832-bp conectează capătul 5′ al intronului 2 la capătul 3′ al exonului 4 (fișier suplimentar 1: Figura S6)., Am detectat două transcrieri în aceste celule: corect îmbinate transcriere, care include 3-bp ștergerea și o transcriere care include intron 2 fuzionat cu exonul 4 (fișier Suplimentar 1: Figura S6c și Tabelul 1). Aceste rezultate sugerează că sărirea aparentă a exonului detectată în populațiile de celule editate ar putea reflecta rearanjamentele genomului care elimină exonii.două experimente susțin ideea că un singur sgRNA poate induce ștergeri genomice mari care elimină exonii., De exemplu, am izolat 15 clone de la mouse-ul 3T3 celule tranzitor transfectate cu Cas9 și Ctnnb1-sg1, și a constatat că patru clone (de exemplu, clone, 4, 5, 13 și 15) a arătat evidentă ignorarea exonului prin RT-PCR. Genomice PCR a arătat genomului rearanjamente în trei dintre aceste clone: deleții mari (>500 bp) și mai mici deleții (~100 bp) în clone 4 și 15, și mare inserții în clone 13 și 15 (fișier Suplimentar 1: Figura S7)., Mai mult decât atât, după vizarea exonul 6 din p65/RelA, am izolat-o biallelic p65 clona (#15): o alelă adăpostește o 1-nt „+O” inserție și alte adăpostește o 2268-bp stergerea care elimină exoni 5, 6, și 7 (fișier Suplimentar 1: Figura S8a, c–e). În p65 clone #15, am detectat transcrierea complet îmbinată și un produs de îmbinare exon 4-8 (fișier suplimentar 1: Figura S8c). Ambele alele codifică transcrierile frameshifted și ambele transcrieri p65 sunt prezente la niveluri mai mici decât WT (fișier suplimentar 1: Figura S8b)., De asemenea, am izolat o clonă P65 editată (#31) homozigotă pentru aceeași + o inserție ca în clona #15, dar clona #31 nu produce transcrieri îmbinate alternativ. Astfel, transcrierea exonului 4-8 îmbinat în clona #15 rezultă din ștergerea exonilor 5, 6 și 7. Aceste evenimente mari de deleție a exonului au fost neașteptate și ar fi omise folosind teste tipice de screening bazate pe PCR.,
capacitatea De a provoca un câștig de funcție activitate prin inducerea ignorarea exonului sau exon excizia sugerat că CRISPR-a meditat de editare folosind un singur sgRNA ar putea fi un mod util de a-parțial salvare funcție de o boală gene care necesită un nivel scăzut de salvare. Repararea ADN-ului omolog mediată de CRISPR a fost utilizată pentru a corecta mutațiile codonului de oprire prematură în gena Dmd într-un model de șoarece al DMD și mai multe grupuri au folosit CRISPR pentru a șterge exonii Dmd și pentru a restabili parțial expresia Dmd . Am proiectat patru lentivirusuri sgRNA / Cas9 care vizează diferite situsuri din exonul 23 al genei Dmd (Fig., 4A, b) și mioblastele c2c12 de șoarece transduse, o linie celulară utilizată pe scară largă ca model pentru distrofia musculară Duchenne (DMD). În celulele C2c12 transduse cu sgRNAs Dmd, am detectat un produs RT-PCR care corespunde produsului normal de îmbinare care conține exon 23. Secvențierea acestor produse RT-PCR a arătat că numai Dmd-SG2 a editat eficient exonul Dmd 23, după cum reiese din vârfuri de secvență mixte dincolo de situl țintă sgRNA (fișier suplimentar 1: Figura S9). În celulele transduse cu Dmd-sg2, am detectat, de asemenea, un produs RT-PCR corespunzător exonului 22 îmbinat cu exonul 24 (Fig. 4c, d)., Astfel, direcționarea exonului 23 cu un singur sgRNA ar putea fi suficientă pentru a induce sărirea parțială a exonului și pentru a produce un cadru de citire deschis distrophin intact. DMD este un exemplu clasic de boală în care o cantitate mică de restaurare funcțională poate oferi beneficii clinice substanțiale .
Un sgRNA vizează exonul 23 de Dmd poate restabili parțial într-cadru distrofinei arnm. o schemă de direcționare sgRNA și sărind peste de mouse-ul Dmd exon 23 și locația de primeri pentru analiza RT-PCR., Omiterea exonului 23 va genera ARNm în cadru. b site-uri țintă Sgrna în Dmd exon 23. c RT-PCR analiza C2C12 mouse-ul myoblast celule transduced cu lentiviruses care codifica Cas9 și sgDmd1, 2, 3, sau 4. Dimensiunile preconizate ale benzii sunt de 353 bp și 140 bp. M marker molecular. d analiza Secvenței de 140-bp adnc trupa din sgDmd2 celulele tratate confirmat despicare de exonul 22 la exonul 24