Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174-deficientní myši byly generovány standardní gene cílení postupy nahradit Gpr174 otevřený čtecí rámec s LacZ/neo kazety pomocí 129SvEvBrd embryonální kmenové buněčné linie (Texas&M Institute for Genomic Medicine, TG0128). Tyto myši s deficitem GPR174 byly po dobu 12 generací přeřazeny na myši c57bl/6. Relevantní myši na C57BL/6 pozadí byly křížili získat ONZP-vyjádření MD4 myši a dsRed-vyjádření GPR174-dostatečné nebo nedostatečné MD4 myši., Pro experimenty byly použity věkově sladěné vrhy mezi 6 a 12 týdny věku a uvedených pohlaví. Velikosti vzorků pro experimenty s myší byly empiricky určeny a myši byly náhodně přiřazeny ke kontrolní nebo experimentální skupině. Pro experimenty s myší zde uvedené nebylo nutné oslepovat. Všechny myši byly udržovány pod specific-pathogen-free podmínky a byly použity v souladu s vládními a Tsinghua Institucionální Animal Péče a Používání Výboru pokyny pro dobré životní podmínky zvířat.,
GPR174–GFP BAC transgenních myší
Sekvence kódující glycin–glycin–glycin–serin (GGGS) linker (opakovat čtyřikrát) a enhanced GFP (EGFP) byly vloženy bezprostředně před stop kodon z GPR174 otevřený čtecí rámec myši BAC klon RP23-206J14 pomocí homologní rekombinace. Upravený BAC byl očištěn a microinjected do pronuclei oplodněných vajíček pro generování transgenních novinářům. Zakladatel myši, které byly promítány pozitivní pro GFP-vyjádření B buněk v krvi byl použit k dalšímu chovu s B6 myší vytvořit GPR174–GFP BAC napětí.,
Buněčné kultury, retroviru a in vitro transdukce
Naivní T lymfocyty anebo B buňky byly izolovány pomocí Negativní CD4 T-cell Isolation Kit nebo Naivní B-cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) podle výrobce protokoly. Na overexpress cílové geny v B buňky, čistí B buňky byly aktivovány s 1 µg ml−1 lipopolysacharid (Sigma) na 1 den předtím, než je spin-infikovaných s retrovirální supernatanty při 1500 g po dobu 2 h, jako described18.
konstrukce chimaér kostní dřeně
B6 přijímající myši byly smrtelně ozářeny rentgenem (5.,5 Gy, dvakrát) a pak dostat intravenózní přenos 3 × 106 sex-uzavřeno buňky kostní dřeně, který se skládá z 80% µMT buňky a 20% GPR174-dostatečné, nebo -deficientní buňky. Chimaery byly použity pro experimenty šest až osm týdnů po rekonstituci.
Gonadectomy
Myši po odstavení byly otupělé s avertin (2.5%, 0.015 ml g−1 tělesné hmotnosti) intraperitoneálně. U ovariektomie samic myší byly vaječníky na obou stranách vystaveny a odstraněny bilaterálními dorzálními řezy., Pro orchidektomie u myších samců, střední břišní řez byl proveden odhalit a odstranit varlata na obou stranách. Podvodné kontrolní myši podstoupily operaci včetně dvoustranných hřbetních řezů nebo středního břišního řezu bez odstranění vaječníků nebo varlat. Otvory pro chirurgické rány byly sešity a antibiotika a analgetika byly aplikovány lokálně. Myši se mohly zotavit po dobu osmi týdnů před následnými experimenty.,
Testosteron léčba
Šest – osm týdnů staré myši byly podkožně injekčně testosteron (10 mg kg−1 tělesné hmotnosti), rozpuštěný ve slunečnicovém olej každý druhý den po dobu dvou týdnů. Myši ovládající vozidlo byly ošetřeny samotným slunečnicovým olejem.
Adoptivní přenos, očkování a virové infekce
změřit germinální centra formace MD4 B buněk, 105 OT-II T-buněk a 5 × 105 MD4 B buňky uvedené genotypy byly intravenózně převedeny do mužského B6 příjemců, které byly následně imunizovány subkutánně s 0.,5 µg lipopolysacharidu a 30 µg Hel–OVA konjugovaného antigenu v Kamenci (Thermo Scientific). HEL-OVA byla vyrobena chemickým zesíťováním pomocí konjugační soupravy HydraLink (SoluLink), jak bylo dříve popsáno19. K měření germinal-centrum tvorby v reakci na SRBC očkování nebo lymfocytární choriomeningitida virus (LCMV) infekce byl myším injikován intraperitoneálně s 5 × 108 SRBCs (od z. Baiji) nebo 2 × 105 jednotek tvořících plak z LCMV Armstrong virus (od L. Ye a R. Ahmed).,
EAE tím, že MOG bílkovin očkování
pořadí kódování prvních 120 aminokyselin lidského MOG byl amplifikován pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) z lidského mozku komplementární DNA knihovny, a klonovaných mezi NdeI a XhoI stránky pET22b+ expresní vektor (Novagen). Lidské MOG protein byl vyjádřen v BL21(DE3) Escherichia coli a purifikovaný jeho karboxy-terminální histidin (His) tag. Čistota a koncentrace bílkovin byly hodnoceny proteinovým testem SDS–PAGE a bcinchoninovou kyselinou (BCA). Rekombinantní proteiny byly skladovány při -80 ° C až do použití., K indukci EAE byla kostní dřeň-chimérická zvířata uvedených typů imunizována subkutánně na boku 200 µg rekombinantního lidského proteinu MOG emulgovaného v adjuvans complete Freund v den 0. Myši byly injikovány intravenózně 200 ng toxinu pertussis (Invitrogen) ve dnech 0 a 2. Myši byly denně sledovány slepým způsobem pro progresi onemocnění od 1.dne. Závažnost onemocnění byla hodnocena jako následující: 0, žádné klinické příznaky; 1, ochrnutý ocas; 2, ztrátu koordinovaného pohybu a paréza zadních končetin; 2.5, ochrnutí jedné zadní končetiny; 3, ochrnutí obou zadních končetin; 3.,5, ochrnutí obou zadních končetin a slabost v přední končetiny; 4, ochrnutí končetiny; a 5, skomírající. Abychom porovnali závažnost onemocnění, studovali jsme deset myší na stav na experiment a analyzovali skóre onemocnění v průběhu času pomocí obousměrné ANOVY.
průtoková cytometrie
Měření antigen-specifických protilátek titry
změřit SRBC-specifické titry protilátek, jsme roztrhli 5 × 108 SRBCs s 1 ml redestilovanou vodu a odstředí je na 15,000 r.p.m. za 20 min., Pelety byly resuspendovány v PBS a použity k kabát MaxiSorp enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) destičky (Nunc Maxisorp) přes noc při 4 °C. K měření MOG-specifické protilátky v séru jsme použili 2 µg ml−1 čištěné rekombinantní lidský MOG kabát ELISA desky. Nespecifická vazba byla blokována 1% bovinní sérový albumin (BSA) v PBS s Tween-20 (PBST) po dobu 2 h při 37 °C, následuje inkubace s 2× sériové ředění vzorky séra imunizovaných myší po dobu 1 h při 37 °C., Destičky byly promyty a inkubovány s křenovou peroxidázou (HRP) konjugovaná s anti-mouse IgG sekundární protilátkou (1/20,000) po dobu 1 h při 37 °C. Destičky byly promyty, vyvinutý s 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB) a zastavil se s 1 M HCl. Nastavili jsme prázdné studny jako nulu a zaznamenali absorbanci při 450 nm. Jako negativní kontrolu jsme použili sera od neimunizovaných myší; mezní hodnotou byla optická hustota při 450 nm (OD450) záporné kontroly vynásobená 2.1. Studna s hodnotou OD450 ne menší než mezní hodnota byla považována za pozitivní., Nejvyšší ředění vzorku, které dalo pozitivitu, je titr vzorku.
Rozdělení B-buněk imunohistochemicky
Pro různé experimenty, naivní B-buňky, B-buňky aktivovány po dobu 1 h s 10 µg ml−1 F(ab‘)2 goat anti-mouse IgM (Jackson Immunoresearch), nebo B buňky transduced s retrovirus byly přeneseny do B6 příjemců. V případě potřeby, tyto buňky byly označeny 1 µM tetramethylrhodamine (TAMRA), 4-chlormethyl-6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin (CMF2HC) nebo 5-chloromethylfluorescein diacetát (CMFDA) (Invitrogen)., Slezinu nebo tříselné mízní uzliny příjemce myši byly fixovány 1% paraformaldehydem po dobu 12 h a pak dehydrovaný v 30% roztoku sacharózy po dobu 12 h při teplotě 4 °C. s cílem zajistit maximální zastoupení různých orgánových oblastí v konečných údajů, jsme zpracovali peníze nesmrdí tkáňových řezů a obarví je s uvedené protilátky. Činidla k barvení zahrnuty eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), rabbit anti-GFP (abcam), a AF488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen)., Diapozitivy byly namontovány s antifádním činidlem ProlongGold (Invitrogen) a vyšetřeny svislým mikroskopem Olympus FV1000. Snímky byly analyzovány pomocí Imaris (Bitplane) a ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
stromatu Sleziny příprava
Slezinu od myší, potkanů a prasat byly opakovaně stisknuto a zem proti kovové pletivo k uvolnění červených krvinek a lymfocytů. Zbývající netušené, amorfní stromální tkáňové prvky byly před umístěním do kultivačního média bez séra B27 (Invitrogen) důkladně omyty PBS a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 12 hodin., U myší byly stromální prvky ze tří zvířat kultivovány v 1 ml médiu. U prasat byly stromální prvky z 1 sleziny kultivovány v 80 ml. Výsledná kultura byla centrifugována při 10000 r.p.m. za 60 min do získání podmíněná střední, která byla buď ihned použity pro experimenty nebo zmrazené při teplotě -20 °C až do použití.
Transwell assay
B buňky aktivované s 1 µg ml−1 lipopolysacharid pro 60 h byly použity pro stanovení různých frakcí vyplývající z biochemických frakcionace., Naivní B lymfocyty anebo B buňky aktivované s 10 µg ml−1 F(ab‘)2 goat anti-mouse IgM (Jackson Immunoresearch) a 10 µg ml−1 anti-CD40 (klon FGK4.5, Bio X Cell) byly použity k testu CCL21 indukované migrace. Když byly porovnány B buňky různých genotypů, k izolaci B buněk v každém experimentu byly použity nejméně tři dárcovské myši každého genotypu a léčba a vždy byly použity littermates. B buňky byly suspendovány při 106 buňkách na mililitr a odpočívány v rpmi médiu obsahujícím 1% FBS při 37 °C po dobu 1 hodiny., Další celkem 100 µl buněčné suspenze bylo přidáno do horní komory v 5-µm-pórů Transwell (Corning Costar), a celkem 150 µl atraktant-obsahující řešení bylo přidáno do spodní komory. Tyto roztoky součástí kultury střední stabilizují se surové myší sleziny stroma příprava kultivačního média stabilizují se surové prasat stromatu sleziny příprava, eluční frakce z chromatografie, kultivační médium obsahující rekombinantní CCL21 a CCL19 (Peprotech), nebo 18/0 LysoPS (Avanti Polar Lipids) uvedené koncentrace., Pro některé experimenty, myší stroma-podmíněné střední byl poprvé doplněn o konečné koncentraci 5 µg ml−1 neutralizačních protilátek proti myší CCL21 nebo CCL19 (R&D systém) nebo kozí IgG izotypů kontrolu, a inkubovány při 4 °C po dobu 3 h, než jsou použity pro transwell assay. Dávka protilátek byla alespoň dostatečná k neutralizaci 100 ng ml-1 CCL21 nebo CCL19, jak bylo stanoveno v předběžných experimentech. Buňky se mohly v inkubátoru převádět po dobu 3 h při 37 °C., Buňky, které migrovaly do spodních jamek, byly vyčísleny průtokovou cytometrií, přičemž fluorescenční buňky A20 známých čísel byly přidány bezprostředně před čtením jako interní počítací standard. Každá podmínka byla měřena ve trojitých jamkách, pokud není uvedeno jinak.
Biochemické frakční
Chromatografie byla provedena pomocí ÄKTApurifer 10 fast protein liquid chromatography (FPLC) system (GE Healthcare) při 4 °C, s výjimkou posledního kroku, který byl proveden pomocí ÄKTAmicro FPLC systému (GE Healthcare)., Celkem 1200 ml prasat stroma-hvězdičkový medium byla použita k aniont-výměnné kolony (250 ml bed objem) do rovnovážného stavu s buffer I (25 mM Hepes, pH 7.0). Sloupec byl promyt třemi objemy sloupců, než byl eluován třemi objemy sloupců pufru i doplněným o 1 m NaCl. Průtokový byla rezerva-změněn s buffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8.5) do 100 ml a znovu se aniont-výměnné kolony vyrovnávají s buffer II. Sloupec byl promyt s dvěma sloupci objemy pufru II a vymývá se dvěma sloupci objemy 0,1–0,5 M lineární gradient NaCl., Byly shromážděny frakce o objemu 10 ml a alikvoty byly změněny pufrem pomocí RPMI 1640 pro transwellův test. Aktivní frakce byly sloučeny a rezerva-změněn na 10 ml pufru II a naloženo na heparin sloupci (5 ml postele objem) do rovnovážného stavu s buffer II. Sloupec byl promyt s 12 sloupci objemy pufru II a vymývá se 4 sloupci objemy 0-2 M lineární gradient NaCl. Byly shromážděny frakce po 2 ml a alikvoty byly změněny pufrem s RPMI 1640 pro transwellův test. Aktivní frakce byly opět sloučeny, buffer-změněn na 0.,5 ml pufru i a naloženo na Superdex-75 sloupci (24 ml postele objem) do rovnovážného stavu s vyrovnávací paměti I. sloup byl pak eluován s jedním sloupcem objem pufru I. Frakce o objemu 0,5 ml byly shromážděny, a alikvoty byly buffer-změnil s RPMI 1640 pro transwell assay. Aktivní frakce byly sloučeny a soustředěna do 0,5 ml, aby zatížení na Mono S sloupec (1 ml postele objem) do rovnovážného stavu s vyrovnávací paměti. I. sloupec byl promyt s 12 sloupci objemy pufru i a eluuje 25 sloupec objemy 0-0.5 M lineární gradient NaCl., Byly shromážděny frakce po 1 ml a alikvoty byly změněny pufrem s RPMI 1640 pro transwellův test. Aktivní frakce byly sloučeny, rezerva-změněn a soustředěna do 50 µl pufrem i a reloaded na Mono S sloupec vyrovnávají s vyrovnávací paměti. I. sloupec se promyje tři sloupce objemy pufru jsem obsahující 0,3 M NaCl, a eluuje 24 sloupec objemy 0,3–0,4 M lineární gradient NaCl., Frakce 1 ml byly sbírány, a alikvoty byly buffer-změnil s RPMI 1640 na konečnou transwell assay pro identifikaci frakce, která obsahovala nejsilnější chemoattractant činnosti.
analýza hmotnostní spektrometrie
frakce z posledního kroku čištění byly koncentrovány do 50 µl a analyzovány na 12% NuPAGE gelů (Invitrogen). Gely byly obarveny skvrnou Pierce silver pro hmotnostní spektrometrii (Thermo Fisher Scientific) podle protokolu výrobce., Pásy se zvýšenou intenzitou ve frakci obsahující nejsilnější chemoattrakční aktivitu byly vyříznuty a podrobeny trávení v gelu před analýzou pomocí hmotnostního spektrometru Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). Data hmotnostní spektrometrie byla analyzována pomocí databáze Swissprot s vyhledávačem maskot.
Jeho-tagged rekombinantní CCL21 a závazné test
myši CCL21 kódování sekvencí byl amplifikován z C57BL/6 myší sleziny cDNA a klonovaných mezi NdeI a XhoI stránky pET22b+ expresní vektor (Novagen), který obsahuje C-terminální Jeho tag., Rekombinantní protein byl exprimován u myší BL21(DE3) a vyčištěn jeho značkou. Čistota a koncentrace bílkovin byly hodnoceny testem SDS–PAGE a BCA a bioaktivita byla ověřena pomocí mobilizačního testu vápníku. Rekombinantní proteiny byly skladovány při -80 ° C až do použití. K měření CCL21–Jeho vazba na GPR174, s CCR7 jako pozitivní kontrola, 293T buňky byly transfektovaly s GPR174–GFP nebo CCR7–GFP fúzní konstrukty., Alikvoty transfektovaly buňky byly poté inkubovány s CCL21–Jeho bílkovin na uvedené koncentrace, při 37 °C po dobu 30 minut, promyje dvakrát studenou PBS a fixovány neprodleně se 4% paraformaldehydem. Po promytí v PBS, fixní buňky byly obarveny s fykoerytrinem-konjugované anti-His protilátkou (klon J095G46, Biolegend) a analyzovány pomocí průtokové cytometrie., GFP− buněk v každém vzorku sloužil jako nespecifické pozadí barvení vnitřní kontroly, a střední fluorescenční intenzity (MFI) GFP+ buňky obarví s fykoerytrinem-konjugované anti-His protilátky, s MFI odpovídající GFP− buněk odečíst, byl použit pro vyčíslení konkrétní CCL21 závazné.
Měření chemokinový spouštěné vápníku tavidla
Myš Gpr174 a Ccr7 byly amplifikovány pomocí PCR a klonován do pRK5 plasmidu. Hek293t buňky byly přechodně transfektovány GPR174-exprimující, CCR7-exprimující nebo kontrolní plazmid., Buňky byly fyzicky odděleny od kultivační nádoby 48 h po transfekci, dvakrát promyty PBS a obarveny 1 µM Indo-1 (Invitrogen) v PBS při 37 °C po dobu 30 minut. Poté, co byly dvakrát promyty PBS, byly buňky resuspendovány s Hanksovým vyváženým solným roztokem (Invitrogen) obsahujícím 25 mm Hepes a 1% FBS a udržovány na ledu. Když se podrobí chemokinový stimulace, buňky byly nejprve přinesl do vody šarže při 37 °C po dobu 5 min inkubace, a pak posuzovány LSR II cytometrem (BD Biosciences) stanovení výchozí hodnoty pro unstimulated státu., Buňky byly stimulovány koncentrační řadou rekombinantního CCL21 v rozmezí od 0, 1 ng ml-1 do 10 µg ml−1. Buňky v každém stavu byly průběžně monitorovány a zaznamenávány po dobu 2 minut. Nakonec byl ionomycin (Sigma) dále přidán do vzorku v konečné koncentraci 1 µg ml−1 a vzorek byl dále sledován a zaznamenán po dobu 1 minuty. Indo-1(vázané)/Indo-1 (volné) poměry byly použity k indikaci intracelulárních koncentrací Ca2+, jak je analyzováno v FlowJo (TreeStar). Nejvyšší koncentrace Ca2 + stimulovaná ionomycinem byla použita jako 100% k normalizaci reakce vápníku vyvolané CCL21., EC50 byl odhadnut v GraphPad tím, že se nastavila křivka tříparametrové, nelineární odpovědi na dávku.
Immunoprecipitation a western blotting
Čerstvě izolovaných myší B-buňky z GPR174–GFP BAC transgenních myší byly aktivovány s 10 µg ml−1 F(ab‘)2 goat anti-mouse IgM a 10 µg ml−1 anti-CD40 za 48 h. Tyto aktivované B buňky byly poté se suspenduje ve 2 × 107 buněk na mililitr v RPMI médiu obsahujícím 1% FBS, a neléčí nebo stimulované s 300 ng. ml−1 CCL21 při 37 °C po dobu 30 min. B buňky byly poté okamžitě lyzovány v 1% NP-40 lýzním pufru (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% nonidet P-40, 20% glycerol a inhibitory proteázy). Pro imunoprecipitaci GFP označeného GPR174 byly lyzáty 108 B buněk inkubovány přes noc s 20 µl perliček GFP–Trap (ChromoTek). Po opakovaném praní, immunoprecipitates byly eluovány pomocí inkubace v 0,2 M Glycin pufru (pH 3.0) po dobu 10 min při teplotě místnosti, a pak se neutralizuje s 1 M Tris-HCl (pH 8.5). Proteiny byly odděleny SDS-PAGE a přeneseny na polyvinylidenovou membránu (Millipore). Membrány byly blokovány Tris pufrovaným fyziologickým roztokem obsahujícím 5% BSA a 0, 1% Tween 20., K detekci cílové molekuly pomocí imunoblotingu, jsme použili králičí anti-GFP (Abcam), rabbit anti-Gai-1 (Abcam), rabbit anti-Gai-2 (Abcam) a rabbit anti-Ga13 (Abcam) protilátek. HRP-konjugovaná kozí protilátka proti králíkům byla zakoupena od Bioeasytech. Imunobloty byly detekovány pomocí zvýšené chemiluminiscence (Thermo Fisher Scientific) a obrazy byly analyzovány pomocí softwaru ImageJ.
Kvantitativní PCR
Buňky požadované typy byly řazeny s FACSAria III a podroben celkové RNA extrakce s RNeasy Plus Mini nebo Micro kit (Qiagen) podle instrukcí výrobce., RNA byla reverzně přepisována pomocí All-In-One RT MasterMix (Abm). Kvantitativní PCR bylo provedeno s qPCR MasterMix (Abm) na 7500 real-Time PCR systému (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., Relativní exprese cílových genů u různých vzorků byla po normalizaci porovnána s expresí genů actb nebo Gapdh.
statistická analýza dat
statistiky a grafy byly provedeny v Prism (Graphpad). Není-li uvedeno jinak, byly k porovnání koncových prostředků různých skupin použity dvouocasé nepárované t-testy studenta.
souhrn zpráv
Další informace o návrhu výzkumu jsou k dispozici v souhrnu zpráv o výzkumu přírody, který je spojen s tímto dokumentem.