Co je Sanger sekvenování?
Sanger sekvenování, také známý jako „ukončení řetězce metodou“, byl vyvinut anglický biochemik Frederick Sanger a jeho kolegy v roce 1977. Tato metoda je určena pro stanovení sekvence nukleotidových bází v kusu DNA (obvykle menší než 1000 bp na délku). Sanger sequencing s 99.,99% základní přesnost je považována za“ zlatý standard “ pro ověření sekvencí DNA, včetně těch, které již byly sekvenovány pomocí sekvenování nové generace (NGS). Sanger sekvenování byl použit v Projektu Lidského Genomu k určení sekvence relativně malých fragmentů lidské DNA (900 bp nebo méně). Tyto fragmenty byly použity k sestavení větších fragmentů DNA a nakonec celých chromozomů.
Sanger sekvenování VS NGS
vývoj NGS technologií urychlil genomický výzkum. NGS může současně sekvenovat více než 100 genů a celých genomů s DNA s nízkým vstupem., Sanger sekvenování zůstává široce používán v sekvenční oblasti, protože nabízí několik významných výhod: (i) nákladové efektivnosti pro sekvenování jednotlivé geny a (ii) 99.99% přesnost, vhodné zejména pro ověření sekvenování pro site-directed mutageneze nebo klonovaných vložky.
Jak funguje sekvenování Sanger?
V Sanger sekvenování, DNA primer komplementární k templátové DNA (DNA sekvence) se používá k být výchozím bodem pro syntézu DNA., V přítomnosti čtyř deoxynucleotide trifosfáty (dntp: A, G, C a T), polymeráza prodlužuje primer přidáním dNTP komplementární k templátové DNA strand. Určit, které nukleotidů je začleněno do řetězce nukleotidů, čtyři dideoxynucleotide trifosforečnanů (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) označen s výraznou fluorescenční barviva se používají k ukončení syntézy reakce. Ve srovnání s dntp, ddNTPs má atom kyslíku odstraní z ribonukleotid, a proto nemůže tvořit spojení s další nukleotid., Po syntéze jsou reakční produkty naloženy do čtyř pruhů jednoho gelu v závislosti na rozmanitém nukleotidu s ukončujícím řetězcem a podrobeny gelové elektroforéze. Podle jejich velikosti je tedy stanovena sekvence DNA.
Obrázek 1. Struktura ddNTP a dNTP.
Image credit: „sekvenování celého genomu: Obrázek 1,“ od OpenStax College, biologie).,
Sanger Sekvenování Kroky,
Sanger metoda sekvenování se skládá z 6 kroků:
(1) dvouvláknové DNA (dsDNA) je denaturována na dvě jednovláknové DNA (ssDNA).
(2) je připojen základní nátěr, který odpovídá jednomu konci sekvence.
(3) jsou přidány čtyři polymerázové roztoky se čtyřmi typy dNTPs, ale pouze jeden typ ddNTP.
(4) reakce syntézy DNA se iniciuje a řetězec se rozšiřuje, dokud není náhodně začleněn terminační nukleotid.
(5) výsledné fragmenty DNA jsou denaturovány do ssDNA.,
(6) denaturované fragmenty jsou odděleny gelovou elektroforézou a je stanovena sekvence.
Obrázek 2. Metoda sekvenování Sanger v 6 krocích (upravená od Gauthiera 2008).