Jsme v poslední době používá CRISPR narušit Kras onkogenu ve dvou nezávislých adenokarcinom plic buněčných linií , které byly odvozeny z Kras G12D; p53 fl/fl (KP) myší . Izolovali jsme dva jednobuněčné klony, z nichž každý nesl delece frameshifting v exonu 2 (obr., 1a a Další soubor 1: Obrázek S1a): KP1 nese 2-nt „-CG“ vypuštění v G12D alela a 1-nt „-C“ mazání v opačném případě wild-type (WT) Kras alelu; a KP2 nese 2-nt „-GG“ smazání. Ani klon produkuje Kras protein v plné délce, což naznačuje, že všechny tři delece narušují rámeček čtení Kras.
sgRNA cílení Kras indukuje exon skipping v jednotlivých buněčných klonů. schéma sgrna zaměřeného na exon 2 genu myši Kras (sgkras)., Červená šipka označuje místo štěpení Cas9. Buněčné linie KP1 a KP2 byly snímány pomocí lentiviru, který kóduje Cas9 a sgkras. Dva jednobuněčné klony (klon KP1 a klon KP2) obsahují odstranění frameshift. Černé šipky označují polohy primerů reverzní transkripce polymerázové řetězové reakce (RT-PCR). Kodon G12D je podtržen. b normalizovaný počet čtení Kras z RNA-sekvenování (RNA-seq) analýza KP rodičovských buněk (modrá) a klonů KP (červená). RNA-seq byla provedena dvakrát pro klon KP2 a třikrát pro ostatní skupiny. „+“označuje alelu WT., c RNA-seq ukazující částečné exon 2 přeskakování v klonech KP1. RNA-seq čísla označují čtení překlenující uvedené exon křižovatky. Jsou zobrazeny dvě reprezentativní biologické replikáty. d RT-PCR analýza Kras mRNA detekuje exon 2 přeskočený pás. Očekávané velikosti pásma jsou 331 bp a 209 bp. M, molekulární marker. „*“označuje indely v produktech PCR z klonů. e Scatter plot ukazuje 22 exon události, které se mění v obou klonů KP1 a KP2. Vyloučení Kras exon 2 je nejčastější událostí., Ψ, Procento Sestřih Index
Posunovými mutacemi v raném exons jsou známo, že vyvolávají nonsense-mediated decay (NMD) , který eliminuje mRNAs s předčasné ukončení kodonů. Když jsme analyzovali mRNA-sequencing (RNA-seq) data, nicméně jsme zjistili, že zdánlivá Kras mRNA (tj. celkem normalizované čte mRNA) byly pouze sníženy o 19% v KP1 buněk a 47% v KP2 buněk, ve srovnání s rodičovskou KP buněk (Obr. 1b). Oba klony produkoval méně exon 2 čte, ale normální hladiny exon 1 a 3 čte (obr., 1C), což naznačuje, že exon 2 může být vynechán v klonech KP1 a KP2. Ve skutečnosti jsme zjistili, exon 1-3 junction čte, což naznačuje, že exon 2 byl přeskočen (obr. 1C a další soubor 1: obrázek S1B). Výpočtu poměru mezi exon 2 čte a celkem čte, jsme zjistili, že exon 2 je zařazeno pouze 64.0 ± 9.1% Kras čte z KP1-klon (Obr. 1C a tabulka 1). Podobné přeskakování exon 2 bylo pozorováno u klonů KP2 (další soubor 1: obrázek S1c)., Concordantly, reverzní transkripce mRNA genu Kras následuje polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) přinesly dva produkty: jeden odpovídal neporušené Kras komplementární DNA (cDNA) a druhý odpovídal exon 1-3 izoformy (Obr. 1d). Na exon 1-3 izoformy zachovává částečné Kras otevřený čtecí rámec, který by mohl zahájit překlad z ATG kodonu v exonu 3 (Další soubor 1: Obrázek S2) a produkují výrazně zkrácen Kras protein.,
Editace Kras nevyvolal alternativní sestřih genomu-široký. Identifikovali jsme 97 alternativně sestříhaných exonů v buňkách KP1 a 177 událostí v buňkách KP2. KP1 a KP2 klony sdílené 22 kazeta zahrnutí nebo vyloučení událostí, s výjimkou úseku Kras exon 2 je největší změna v obou klonů (Obr. 1e a další soubor 1: tabulka S3). Tím pádem, editace Kras exon 2 specificky indukované přeskakování kras exon 2., Zejména, vzhledem k tomu, že myš Kras G12D (GG na GAU) přepisy nevynechávejte exon 2 v rodičovské KP buněk, zjistili jsme, že ~15% lidských KRAS G12S (kodon 12 GG na AGU) přepisy přeskočení exonu 2 v A549 lidské rakoviny plic buněčných linií (Další soubor 1: Obrázek S1d). Nebyli jsme schopni předpovědět zisk nebo ztrátu exon splice zesilovače nebo tlumiče, ale naše data naznačují, že sekvence poblíž Kras codon 12 podporovat exon 2 začlenění do myši a lidské Kras. Exon přeskakování vyvolané editací CRISPR nebylo omezeno na Kras nebo myší KP buňky., Nedávná studie ukázala, že editace CRISPR FLOT1 exon 3 v buňkách HeLa může způsobit přeskočení exon 3, exon 4 nebo exons 3, 4 a 5 . Také jsme zjistili časté exon skipping, když jsme cílené exon 11 LMNA u lidských buněk HCT116 (Další soubor 1: Obrázek S3). Přeskočení lmna exon 11 vytváří in-frame přepis, který by mohl být přeložen do neomorfního proteinu.
dále prozkoumat myšlenku, že exon skipping může produkovat funkční in-frame přepis, jsme se zeptali, zda CRISPR-zprostředkované editace Ctnnb1 exon 3 může vyvolat exon skipping a způsobit gain-of-function fenotyp., Exon 3 Ctnnb1 kóduje phosphoacceptor zbytky, které podporují degradaci β-Catenin transkripční faktor ; genetické excize Ctnnb1 exon 3—, který je v záběru s exon 4—stabilizuje a constitutively aktivní β-Catenin, který se hromadí v jádře . Navrhli jsme 11 sgRNAs, že cílové regiony podél Ctnnb1 exon 3 (Ctnnb1-sg-1 k -sg11), transduced jednotlivých sgRNAs do KP buněk, a používá high-throughput sekvenování analyzovat rozsah úprav na sgRNA cílové místo v každé linii (Obr. 2B osa x, další soubor 1: obrázek S4 a další soubor 2: Tabulka S4)., Tři sgrna (SG6, sg9 a Sg10) neefektivně cílené Ctnnb1. Osm z ctnnb1 sgrna (SG1 až SG5, sg7, sg8 a sg11) však indely indukovalo na svých cílových místech s frekvencemi, které překročily 20%. Například Ctnnb1-SG1 generoval + t vložení v asi 65% čtení (obr. 2c). V každé populaci, na kterou se zaměřuje silná Ctnnb1 sgRNA, jsme zjistili tři produkty RT-PCR, které pokrývají exony 2 až 5 (obr. 2d). Hlavní produkt odpovídá normálně spojenému přepisu, který zahrnuje exon 3. Další dva produkty odpovídají alternativně spojeným přepisům: ten, který přeskočí exon 3 (tj., exon 2-4 sestřih, obr. 2e) a ten, který přeskočí oba exony 3 a 4 (tj. 2f). Ctnnb1 sgrna zaměřené buď na DNA řetězec indukovaný exon přeskakování a Cas9 nukleázová aktivita byla nezbytná pro exon přeskakování (obr. 3a).
Ctnnb1 sgrna cílení exon 3 indukuje přeskakování exonu. schéma genu Ctnnb1. V rámu exon 3 kóduje inhibiční domény: fosforylace aminokyselin, 33, 37, 41 a 45, podporuje odbourávání β-Catenin bílkovin., Ztráta exonu 3 stabilizuje β-Katenin. Jedenáct sgrna bylo navrženo tak, aby se zaměřilo na exon 3: silné sgrna v červené a slabé sgrna v černé barvě. sgrna, které používají“ NGG “ PAM, jsou uvedeny výše exon 3 a ty, které používají „CCN“ PAM, jsou uvedeny níže exon 3. B korelace mezi přeskakováním exon 3 a účinností sgRNA. Genomické indely byly měřeny hlubokým sekvenováním. Buňky KP byly infikovány lentivirem. Exon 3 přeskakování účinnosti jsou z (d). Indely sg11 nebyly určeny. sgrna, které indukují> 20% indelů, jsou označeny červeně., C distribuce indelů SG1 ukazuje, že nejčastější byla vložení T (+T) v místě štěpení Cas9 nukleotid 97 exonu 3 (červená šipka). PAM sekvence je v modré barvě. d RT-PCR pomocí primerů klenout exons 2 a 5 ukazuje částečné exon přeskakování. M molekulární marker. sgGFP je kontrolní sgRNA. Exon 3 přeskakovací pásma byla kvantifikována pomocí softwaru ImageQuant TL a normalizována na celé délky cDNA pásem. sg4 vykazovala viditelné slabé pásma, které nebylo možné kvantifikovat., e, f topo klonování a Sanger sekvenování potvrdil, že dva hlavní nižší RT-PCR pásma v (c)jsou alternativní sestřih exon 2-4 a exon 2-5, resp. g Západní blot analýza β-Catenin. Celovečerní β-Catenin je ~86 kD. β-Katenin bez exonu 3 (delta exon 3) je ~77 kDa. Aktin sloužil jako kontrola zatížení
Cas9 nuclease činnosti, nutné k vynechání jednoho nebo více exonů., RT-PCR analýza Ctnnb1 mRNA v KP buňky transduced s lentiviruses, které kódují sgCtnnb1.2 a nuclease-vadný Cas9 (dCas9), dCas9-KRAB fusion, nebo WT Cas9. RT-PCR byla provedena pomocí primerů v exonech 2 a 7 na transdukovaných populacích buněk KP po výběru puromycinu a třídění FACS. Zobrazí se délka exonu a fáze čtecího rámce. Pouze produkt exon 2-4 splice zachovává kódovací sekvenci β-Catenin v rámci. B RT-PCR analýza ctnnb1 mRNA v buňkách KP přenášených lentiviry, které kódují Cas9 a sggfp, SG3 nebo SG5., „–“, neléčená
Western blot analýza ukázala, že buněčné populace transduced s silný sgRNAs vyrábět menší ~74 kD β-Catenin protein, který odpovídá velikosti, jež se očekává od exon 2-4 splice produktu (Obr. 2g). Protein β-Katenin v plné délce nebyl čtyři dny po transdukci významně vyčerpán. Otestovat, zda alternativní sestřih je závislá na kontinuální výraz Cas9 nebo sgRNA v lentiviral vektory, jsme společně transfektovaly Cas9 a Ctnnb1-sg1 nebo non-cílení sgRNA kontrolu., Sedm dní po transfekci, kdy by měly být transfekce Cas9 a vodicích RNA vyčerpány, jsme zkoumali lokalizaci β-Katenin imunofluorescencí. V myších fibroblastů, buněk transfektovaly s non-cílení ovládání sgRNA, β-Catenin lokalizované na buněčné spoje (Další soubor 1: Obrázek S5a). Naproti tomu v mnoha buňkách transfekovaných Ctnnb1-SG1 jsme detekovali β-Katenin v jádru (další soubor 1: obrázek S5a)., Tyto výsledky naznačují, že pro přeskakování exonu není nutná nepřetržitá editace a že přeskakování exon 3 vyvolané editací Ctnnb1 exon 3 zprostředkovanou CRISPR vytváří izoform β-Catenin.
dále Jsme analyzovali přepisy spanning exons 2 až 7 v buněčných populací léčených Ctnnb1-sg2, -sg3 a sg5. Kromě full-délka izoformy, jsme zaznamenali čtyři přepisy s exon 2 zřejmě sestříhané, aby každý následný exon (tj. exon 2-4, exon 2-5, exon 2-6, a exon 2-7; Obr. 3a, b)., Nechceme pochopit mechanismus tohoto zdánlivě promiskuitní exon skipping vyvolané Ctnnb1 exon 3 editace, ani jsme nebyli schopni korelovat promiskuitní exon skipping s specifické cílové stránky nebo indel mutací v exonu 3. Přesto jsme izolovali klon upravený Ctnnb1 – SG3, který naznačuje potenciální mechanismus (další soubor 1: obrázek S6a). Tento biallelic klon obsahuje 3-bp in-frame delece na jedné alely a velké 832-bp delece na druhé; 832-bp delece pojistky na 5′ konci intron 2 k 3′ konci exonu 4 (Další soubor 1: Obrázek S6)., Zaznamenali jsme dva přepisy v těchto buňkách: správně sestříhané přepis, který zahrnuje 3-bp výmaz a přepis, který obsahuje intron 2 pojistkou na exon 4 (Další soubor 1: Obrázek S6c a Tabulka 1). Tyto výsledky naznačují, že zjevné exon přeskakování zjištěné v populacích upravených buněk by mohlo odrážet přeskupení genomu, které odstraní exony.
dva experimenty podporují myšlenku, že jedna sgRNA může vyvolat velké genomické delece, které odstraňují exony., Například jsme izolovaných 15 klony od myši 3T3 buňky přechodně transfektovaly s Cas9 a Ctnnb1-sg-1, a zjistil, že čtyři klony (tj. klony, 4, 5, 13, a 15) ukázal, zjevný exon skipping pomocí RT-PCR. Genomické PCR odhalila přestavby v genomu tři z těchto klonů: velké delece (>500 bp) a menší delece (~100 bp) v klony 4 a 15, a velký inzerce v klony 13 a 15 (Další soubor 1: Obrázek S7)., Navíc, po zaměření exon 6 p65/Odpo jsme izolovali biallelic p65 klon (#15): jedna alela skrývá 1-nt „+“ vložení a ostatní přístavy na 2268-bp delece, že odstraňuje exons 5, 6, a 7 (Další soubor 1: Obrázek S8a, c–e). V klonu P65 # 15 jsme zjistili plně sestříhaný přepis a produkt exon 4-8 splice (další soubor 1: obrázek S8c). Oba alely kódují frameshifted přepisy a oba P65 přepisy jsou přítomny na nižších úrovních než WT (další soubor 1: obrázek S8b)., Také jsme izolovali upravený klon p65 (#31) homozygotní pro stejný + vložení jako v klonu #15, ale klon #31 nevytváří alternativně sestříhané přepisy. Exon 4-8 tedy spliced přepis v klonu #15 vyplývá z vymazání exonů 5, 6 a 7. Tyto velké exon delece události byly neočekávané a bude chybět pomocí typické PCR založené screeningové testy.,
schopnost způsobit gain-of-function činnosti vyvolávající exon skipping nebo exon excize navrhl, že CRISPR-meditoval editace pomocí jediného sgRNA může být užitečný způsob, jak částečně zachránit funkce gen nemoc, která vyžaduje nízkou úroveň záchranu. CRISPR-zprostředkované homologní DNA opravy bylo použito k opravě předčasného stop kodonu mutace v genu Dmd, v myším modelu DMD a několik skupin se používá CRISPR odstranit Dmd exonů a částečně obnovit Dmd výraz . Navrhli jsme čtyři lentiviry sgRNA / Cas9, které se zaměřují na různá místa v exonu 23 genu Dmd(obr., 4A, b) a transdukované myoblasty myši c2c12, buněčná linie široce používaná jako model pro duchenneovu svalovou dystrofii (DMD) . V buňkách c2c12 přenášených Dmd sgrna jsme zjistili produkt RT-PCR, který odpovídá normálnímu produktu splice obsahujícímu exon 23. Sekvenování tyto RT-PCR produktů ukázal, že pouze Dmd-sg2 efektivně upravovat Dmd exonu 23, o čemž svědčí smíšené pořadí vrcholů nad sgRNA cílové stránky (Další soubor 1: Obrázek S9). V buňkách přenášených Dmd-SG2 jsme také detekovali produkt RT-PCR odpovídající exon 22 spojenému s exon 24(obr. 4c, d)., Tak cílení exon 23 s jedním sgRNA může být dostačující k vyvolání částečného exon přeskakování a produkovat neporušený dystrofin otevřený čtecí rámec. DMD je klasickým příkladem onemocnění, při kterém malé množství funkční obnovy může poskytnout značný klinický přínos .
sgRNA cílení exon 23 Dmd může částečně obnovit v-rám dystrofin mRNA. schéma cílení sgRNA a přeskakování myši Dmd exon 23 a umístění primerů pro analýzu RT-PCR., Přeskakování exon 23 bude generovat v rámci mRNA. B sgrna cílové stránky v Dmd exon 23. c RT-PCR analýza myoblastových buněk myši c2c12 přenášených lentiviry, které kódují Cas9 a sgdmd1, 2, 3 nebo 4. Očekávané velikosti pásma jsou 353 bp a 140 bp. M molekulární marker. d Sekvenční analýzu 140-bp cDNA kapela z sgDmd2 ošetřených buněk potvrzen sestřihu exon 22 exon 24