Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174-defiziente Mäuse wurden durch Standard-Gen-Targeting-Verfahren erzeugt, um den offenen Leserahmen Gpr174 durch eine lacZ/neo-Kassette unter Verwendung der embryonalen Stammzelllinie 129SvEvBrd zu ersetzen (Texas A&M Institute for Genomic Medicine, TG0128). Diese GPR174-defizienten Mäuse wurden 12 Generationen lang zu C57BL/6-Mäusen zurückcrossed. Relevante Mäuse auf dem C57BL/6-Hintergrund wurden interbred, um GFP-exprimierende MD4-Mäuse und dsRed-exprimierende GPR174-ausreichende oder-defiziente MD4-Mäuse zu erhalten., Age-matched Wurfgeschwister zwischen 6 und 12 Wochen alt und die angegebene Geschlechter wurden für Experimente nutzte. Die Stichprobengrößen für die Maus-Experimente wurden empirisch bestimmt, und die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip zugewiesen, um Steuern oder experimentelle Gruppe. Für die hier vorgestellten Mausexperimente war keine Blendung notwendig. Alle Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen gehalten und gemäß den Richtlinien des staatlichen und Tsinghua Institutional Animal Care and Use Committee für den Tierschutz verwendet.,
GPR174-GFP BAC transgene Mäuse
Sequenzen, die für den Glycin–Glycin–Glycin–Serin-Linker (GGGS) kodieren (viermal wiederholt) und verbessertes GFP (EGFP) wurden unmittelbar vor dem Stoppcodon des offenen Leserahmens GPR174 im Maus-BAC-Klon RP23-206J14 durch homologe Rekombination eingefügt. Der modifizierte BAC wurde gereinigt und in die Vorkerne befruchteter Eizellen mikroinjektiert, um transgene Reporter zu erzeugen. Eine Founder-Maus, die positiv auf GFP-exprimierende B-Zellen im Blut untersucht wurde, wurde verwendet, um mit B6–Mäusen weiter zu züchten, um den GPR174-GFP-BAC-Stamm zu etablieren.,
Zellkultur, Retrovirus und In vitro-Transduktion
Naive T-Zellen oder B-Zellen wurden unter Verwendung des negativen CD4-T-Zell-Isolationskits oder des naiven B-Zell-Isolationskits (Miltenyi Biotec) gemäß den Protokollen des Herstellers isoliert. Um Zielgene in B-Zellen zu überexprimieren, wurden gereinigte B-Zellen 1 Tag lang mit 1 µg ml−1 Lipopolysaccharid (Sigma) aktiviert, bevor sie mit retroviralen Überständen bei 1.500 g für 2 h spininfiziert wurden18.
Aufbau von Knochenmarkschimären
B6 Empfängermäuse wurden mit Röntgenstrahlen tödlich bestrahlt (5.,5 Gy, zweimal) und dann einen intravenösen Transfer von 3 × 106 geschlechtsspezifischen Knochenmarkzellen, bestehend aus 80% µMT-Zellen und 20% GPR174-ausreichenden oder-defizienten Zellen, erhalten. Chimären wurden sechs bis acht Wochen nach der Rekonstitution für Experimente verwendet.
Gonadektomie
Mäuse wurden nach der Entwöhnung intraperitoneal mit Avertin (2,5%, 0,015 ml g−1 Körpergewicht) betäubt. Bei der Ovariektomie weiblicher Mäuse wurden Eierstöcke auf beiden Seiten freigelegt und durch bilaterale dorsale Einschnitte entfernt., Zur Orchidektomie bei männlichen Mäusen wurde ein mittlerer Bauchschnitt vorgenommen, um Hoden auf beiden Seiten freizulegen und zu entfernen. Schein-operierte Kontrollmäuse wurden operiert, einschließlich bilateraler dorsaler Einschnitte oder eines mittleren Bauchschnitts ohne Entfernung von Eierstöcken oder Hoden. Chirurgische Wundöffnungen wurden vernäht und Antibiotika und Analgetika lokal angewendet. Mäuse durften sich vor nachfolgenden Experimenten acht Wochen lang erholen.,
Testosteronbehandlung
Sechs bis acht Wochen alte Mäuse wurden zwei Wochen lang jeden zweiten Tag subkutan Testosteron (10 mg kg – 1 Körpergewicht) in Sonnenblumenöl gelöst injiziert. Fahrzeugkontrollmäuse wurden allein mit Sonnenblumenöl behandelt.
Adoptivübertragung, Immunisierung und Virusinfektion
Zur Messung der Keimzentrumbildung durch MD4-B-Zellen wurden 105 OT-II-T-Zellen und 5 × 105 MD4-B-Zellen indizierter Genotypen intravenös in männliche B6-Empfänger übertragen, die anschließend subkutan mit 0 immunisiert wurden.,5 µg Lipopolysaccharid und 30 µg HEL-OVA-Konjugat-Antigen in Alaun (Thermo Scientific). Die HEL-OVA wurde durch chemische Vernetzung mit einem HydroLink-Konjugationskit (SoluLink) hergestellt, wie zuvor beschrieben19. Zur Messung der Keimzentrumbildung als Reaktion auf eine SRBC-Immunisierung oder lymphozytäre Choriomeningitis-Virus (LCMV) – Infektion wurden Mäusen intraperitoneal 5 × 108 SRBCs (von Z. Baiji) oder 2 × 105 Plaque-bildende Einheiten des LCMV-Armstrong-Virus (von L. Ye und R. Ahmed) injiziert.,
EAE durch MOG-Protein-Immunisierung
Die Sequenz, die die ersten 120 Aminosäuren des menschlichen MOG kodiert, wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus einer komplementären DNA-Bibliothek des menschlichen Gehirns amplifiziert und zwischen den NdeI-und XhoI-Stellen des pET22b+ – Expressionsvektors (Novagen) geklont. Humanes MOG-Protein wurde in BL21(DE3) Escherichia coli exprimiert und durch sein carboxy-terminales Histidin (His) – Tag gereinigt. Protein Reinheit und Konzentration wurden durch SDS–PAGE und Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay bewertet. Rekombinante Proteine wurden bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert., Um EAE zu induzieren, wurden knochenmark-chimäre Tiere indizierter Typen subkutan an der Flanke mit 200 µg rekombinantem humanem MOG-Protein immunisiert, das am Tag 0 in Complete Freund ‚ s Adjuvant emulgiert wurde. Den Mäusen wurden an den Tagen 0 und 2 intravenös 200 ng Pertussistoxin (Invitrogen) injiziert. Mäuse wurden täglich blind auf das Fortschreiten der Krankheit vom ersten Tag an überwacht. Der Schweregrad der Erkrankung wurde wie folgt bewertet: 0, keine klinischen Anzeichen; 1, gelähmter Schwanz; 2, Verlust der koordinierten Bewegung und Parese der Hinterbeine; 2.5, Lähmung einer Hinterbeine; 3, Lähmung beider Hinterbeine; 3.,5, Lähmung beider Hintergliedmaßen und Schwäche in Vordergliedmaßen; 4, Lähmung von Vordergliedmaßen; und 5, Moribund. Um den Schweregrad der Erkrankung zu vergleichen, untersuchten wir zehn Mäuse pro Erkrankung und Experiment und analysierten die Krankheitswerte im Laufe der Zeit mit einer bidirektionalen ANOVA.
Durchflusszytometrie
Messung antigen-spezifischer Antikörpertiter
Zur Messung SRBC-spezifischer Antikörpertiter lysierten wir 5 × 108 SRBCs mit 1 ml doppelt destilliertem Wasser und zentrifugierten sie bei 15.000 r. p. m. für 20 min., Das Pellet wurde in PBS resuspendiert und verwendet, um MaxiSorp Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Platten (Nunc Maxisorp) über Nacht bei 4 °C zu beschichten.Um MOG-spezifische Serumantikörper zu messen, verwendeten wir 2 µg ml−1 gereinigtes rekombinantes humanes MOG, um die ELISA-Platten zu beschichten. Die unspezifische Bindung wurde mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit Tween-20 (PBST) für 2 h bei 37 °C blockiert, gefolgt von der Inkubation mit 2× seriellen Verdünnungen von Serumproben immunisierter Mäuse für 1 h bei 37 °C., Die Platten wurden gewaschen und mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugiertem Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (1/20,000) für 1 h bei 37 °C inkubiert.Die Platten wurden gewaschen, mit 3,3′,5,5′ – Tetramethylbenzidin (TMB) entwickelt und mit 1 M HCl gestoppt. Wir setzten leere Vertiefungen auf Null und zeichneten die Absorption bei 450 nm auf. Wir verwendeten Seren von nicht immunisierten Mäusen als Negativkontrolle; Der Grenzwert war die optische Dichte bei 450 nm (OD450) der Negativkontrolle multipliziert mit 2.1. Ein Brunnen mit einem OD450-Wert von nicht weniger als dem Grenzwert wurde als positiv angesehen., Die höchste Verdünnung einer Probe, die Positivität ergab, ist der Titer der Probe.
Verteilung von B-Zellen durch Immunhistochemie
Für verschiedene Experimente wurden naive B−Zellen, B-Zellen, die für 1 h mit 10 µg ml-1 F(ab‘)2 goat anti-Mouse IgM (Jackson Immunoresearch) aktiviert wurden, oder B-Zellen, die mit Retrovirus transduziert wurden, in B6-Empfänger übertragen. Bei Bedarf wurden diese Zellen mit 1 µM Tetramethylrhodamin (TAMRA), 4-Chlormethyl-6,8-difluoro-7-Hydroxycoumarin (CMF2HC) oder 5-Chloromethylfluoresceindiacetat (CMFDA) (Invitrogen) markiert., Milz-oder Leistenlymphknoten der Empfängermäuse wurden 12 h lang mit 1% Paraformaldehyd fixiert und dann 12 h lang in 30% Saccharoselösung bei 4 °C dehydriert, um eine maximale Repräsentation verschiedener Organregionen im endgültigen Datensatz zu gewährleisten, verarbeiteten wir nicht konsekutive Gewebeabschnitte und färbten sie mit indizierten Antikörpern. Färbung Reagenzien enthalten eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), Kaninchen-anti-GFP (abcam), und AF488 Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Invitrogen)., Die Dias wurden mit dem Gold Antifade Reagenz (Invitrogen) montiert und mit einem Olympus FV1000 Upright Mikroskop untersucht. Bilder wurden analysiert, mit Imaris (Bitplane) und ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
Splenic stroma preparation
Milben von Mäusen, Ratten oder Schweinen wurden wiederholt gegen ein Metallgitter gepresst und gemahlen, um rote Blutkörperchen und Lymphozyten freizusetzen. Die verbleibenden, nicht reproduzierbaren, amorphen stromalen Gewebeelemente wurden gründlich mit PBS gewaschen, bevor sie in ein B27 serumfreies Kulturmedium (Invitrogen) gegeben und 12 h bei 37 °C inkubiert wurden., Bei Mäusen wurden Stromal-Elemente von drei Tieren in 1 ml Medium kultiviert. Bei Schweinen wurden Stromaelemente aus 1 Milz in 80 ml kultiviert. Die resultierende Kultur wurde bei 10.000 r. p. m. für 60 min zentrifugiert, um das konditionierte Medium zu erhalten, das entweder sofort für Experimente verwendet oder bis zur Verwendung bei -20 °C eingefroren wurde.
Transwell Assay
B−Zellen, die mit 1 µg ml-1 Lipopolysaccharid für 60 h aktiviert wurden, wurden verwendet, um verschiedene Fraktionen zu untersuchen, die aus biochemischer Fraktionierung resultierten., Naive B-Zellen oder B-Zellen aktiviert, die mit 10 µg ml−1 F(ab‘)2 Ziege-anti-Maus-IgM (Jackson Immunoresearch) und 10 µg ml−1-anti-CD40 (Klon FGK4.5, Bio X Cell) wurden verwendet, um die assay-ccl21 zu Wandern-induzierte migration. Wenn B-Zellen verschiedener Genotypen verglichen wurden, wurden mindestens drei Spendermäuse jedes Genotyps und jeder Behandlung verwendet, um B-Zellen in jedem Experiment zu isolieren, und Würfe wurden immer verwendet. B-Zellen wurden bei 106 Zellen pro Milliliter suspendiert und 1 h lang in RPMI-Medium mit 1% FBS bei 37 °C ruht., Als nächstes wurden der oberen Kammer insgesamt 100 µl Zellsuspension in einem 5-µm-Porentranswell (Corning Costar) zugesetzt und der unteren Kammer insgesamt 150 µl lockstoffhaltige Lösungen zugesetzt. Diese Lösungen umfassten Kulturmedium konditioniert mit roher Maus splenic Stroma Vorbereitung, Kulturmedium konditioniert mit roher Schweine splenic Stroma Vorbereitung, Elution Fraktionen aus Chromatographie, Kulturmedium mit rekombinanten CCL21 und CCL19 (Peprotech), oder 18/0 LysoPS (Avanti Polar Lipids) von angegebenen Konzentrationen., Für einige Experimente wurde das murine Stroma-konditionierte Medium zunächst mit einer Endkonzentration von 5 µg ml−1-neutralisierenden Antikörpern gegen das CCL21-oder CCL19-System der Maus (R&D-System) oder die IgG-Isotypkontrolle der Ziege ergänzt und 3 h bei 4 °C inkubiert, bevor es für den Transwell-Assay verwendet wurde. Die Antikörperdosis war zumindest ausreichend, um 100 ng ml−1 CCL21 oder CCL19 zu neutralisieren, wie in Vorversuchen bestimmt. Die Zellen durften 3 h bei 37 °C in einem Inkubator transmigrieren., Zellen, die zu den unteren Vertiefungen gewandert waren, wurden durch Durchflusszytometrie aufgezählt, wobei fluoreszierende A20-Zellen bekannter Zahlen unmittelbar vor dem Lesen als interner Zählstandard hinzugefügt wurden. Jede Bedingung wurde in dreifacher Ausführung gemessen, sofern nicht anders angegeben.
Biochemische Fraktionierung
Die Chromatographie wurde mit einem ÄKTApurifer 10 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System (GE Healthcare) bei 4 °C durchgeführt, mit Ausnahme des letzten Schritts, der mit einem ÄKTAmicro FPLC System (GE Healthcare) durchgeführt wurde., Insgesamt wurden 1.200 ml porcine Stroma-konditioniertes Medium auf eine Anionenaustauschsäule (250 ml Bettvolumen) aufgebracht, die mit Puffer I (25 mm Hepes, pH 7,0) ausgeglichen war. Die Säule wurde mit drei Säulenvolumina gewaschen, bevor sie mit drei Säulenvolumina des Puffers I, ergänzt mit 1 M NaCl, eluiert wurde. Der Durchfluss wurde mit Puffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8,5) in 100 ml puffert und wieder auf eine mit Puffer II ausgeglichene Anionenaustauschsäule aufgebracht.Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina von Puffer II gewaschen und mit zwei Säulenvolumina eines 0,1–0,5 M linearen NaCl-Gradienten eluiert., Fraktionen von jeweils 10 ml wurden gesammelt und Aliquots wurden mit RPMI 1640 für den Transwell-Assay pufferverändert. Aktive Fraktionen wurden gebündelt und in 10 ml mit Puffer II puffert und auf eine Heparinsäule (5 ml Bettvolumen) geladen, die mit Puffer II ausgeglichen war. Die Säule wurde mit 12 Säulenvolumina von Puffer II gewaschen und mit 4 Säulenvolumina von 0-2 M linearem NaCl-Gradienten eluiert. Fraktionen von jeweils 2 ml wurden gesammelt und Aliquots wurden mit RPMI 1640 für den Transwell-Assay pufferverändert. Aktive Fraktionen wurden wieder gebündelt, Puffer-in 0 geändert.,5 ml Puffer I und geladen auf eine Superdex-75-Säule (24 ml Bettvolumen), die mit Puffer I ausgeglichen war.Die Säule wurde dann mit einem Säulenvolumen von Puffer I eluiert. Fraktionen von jeweils 0,5 ml wurden gesammelt, und Aliquots wurden mit RPMI 1640 für den Transwell-Assay puffert. Aktive Fraktionen wurden gebündelt und in 0,5 ml konzentriert, um auf eine Mono-S-Säule (1 ml Bettvolumen) zu laden, die mit Puffer I ausgeglichen war.Die Säule wurde mit 12 Säulenvolumina von Puffer I gewaschen und mit 25 Säulenvolumina von 0-0, 5 M linearem NaCl-Gradienten eluiert., Fraktionen von je 1 ml wurden gesammelt und Aliquots wurden mit RPMI 1640 für den Transwell-Assay pufferverändert. Aktive Fraktionen wurden gebündelt, pufferverändert und in 50 µl mit Puffer I konzentriert und auf die Mono–S-Säule geladen, die mit Puffer I ausgeglichen war.Die Säule wurde mit drei Säulenvolumina von Puffer I gewaschen, die 0,3 M NaCl enthielten, und mit 24 Säulenvolumina von 0,3-0,4 M linearem NaCl-Gradienten eluiert., Fraktionen von jeweils 1 ml wurden gesammelt, und Aliquots wurden mit RPMI 1640 für den endgültigen Transwell-Assay pufferverändert, um die Fraktion zu identifizieren, die die stärkste Chemoattraktionsaktivität enthielt.
Massenspektrometrie-Analyse
Fraktionen aus dem letzten Reinigungsschritt wurden in 50 µl konzentriert und auf 12% NuPAGE-Gele (Invitrogen) analysiert. Gele wurden mit dem gleichen Silberfleck für die Massenspektrometrie (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Herstellerprotokoll gefärbt., Bänder mit erhöhter Intensität in der Fraktion, die die stärkste chemoattraktive Aktivität enthielten, wurden ausgeschnitten und einer In-Gel-Verdauung unterzogen, bevor sie mit einem Q Exactive HF-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) analysiert wurden. Die Massenspektrometriedaten wurden mit Hilfe der Datenbank Swissprot mit der Suchmaschine MASCOT ausgewertet.
His-markierte rekombinante CCL21 und Bindungstest
Die Maus-CCL21-Kodierungssequenz wurde aus C57BL/6-Maus-Milz-cDNA amplifiziert und zwischen den NdeI-und XhoI-Stellen des pET22b+ – Expressionsvektors (Novagen) geklont, der ein C-terminales His-Tag bereitstellt., Das rekombinante Protein wurde in BL21(DE3) – Mäusen exprimiert und durch sein His-Tag gereinigt. Proteinreinheit und–konzentration wurden durch SDS-PAGE-und BCA-Assay bewertet, und die Bioaktivität wurde unter Verwendung eines Calciummobilisierungstests verifiziert. Rekombinante Proteine wurden bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Zur Messung der CCL21-His-Bindung an GPR174 mit CCR7 als Positivkontrolle wurden 293T-Zellen mit GPR174–GFP–oder CCR7-GFP-Fusionskonstrukten transfiziert., Aliquots transfektierter Zellen wurden dann mit CCL21–His-Protein in angegebenen Konzentrationen bei 37 °C für 30 min inkubiert, zweimal mit kaltem PBS gewaschen und sofort mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach dem Waschen in PBS wurden die fixierten Zellen mit einem Phycoerythrin-konjugierten Anti-His-Antikörper (Klon J095G46, Biolegend) gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert., GFP-Zellen in jeder Probe dienten als unspezifische Hintergrundfärbung interne Kontrolle, und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von GFP+-Zellen, die mit Phycoerythrin-konjugiertem Anti− His-Antikörper gefärbt waren, wobei der MFI entsprechender GFP-Zellen subtrahiert wurde, wurde verwendet, um die spezifische CCL21-Bindung zu quantifizieren.
Messung von Chemokin-ausgelösten Calciumflüssen
Maus Gpr174 und Ccr7 wurden durch PCR amplifiziert und in das pRK5-Plasmid geklont. HEK293T-Zellen wurden vorübergehend mit GPR174-exprimierendem, CCR7-exprimierendem oder Kontrollplasmid transfektiert., Die Zellen wurden 48 h nach der Transfektion physikalisch aus dem Kulturgefäß gelöst, zweimal mit PBS gewaschen und 30 min lang mit 1 µM Indo-1 (Invitrogen) in PBS bei 37 °C gefärbt. Nachdem die Zellen zweimal mit PBS gewaschen worden waren, wurden sie mit Hanks‘ Balanced Salt Solution (Invitrogen), die 25 mm Hepes und 1% FBS enthielt, resuspendiert und auf Eis gehalten. Bei einer Chemokinstimulation wurden die Zellen zunächst für 5 Minuten Inkubation bei 37 °C in eine Wassercharge gebracht und dann mit einem LSR II-Zytometer (BD Biosciences) bewertet, um die Basislinie für den unstimulierten Zustand festzulegen., Die Zellen wurden mit einer Konzentrationsreihe rekombinanter CCL21 im Bereich von 0,1 ng ml−1 bis 10 µg ml−1 stimuliert. Zellen bei jedem Zustand wurden kontinuierlich überwacht und für 2 min aufgezeichnet. Am Ende wurde der Probe Ionomycin (Sigma) in einer Endkonzentration von 1 µg ml−1 zugesetzt, und die Probe wurde weiter überwacht und für 1 min aufgezeichnet. Indo-1(gebunden)/Indo-1(frei) – Verhältnisse wurden verwendet, um intrazelluläre Ca2+ – Konzentrationen anzuzeigen, wie sie in FlowJo (TreeStar) analysiert wurden. Die höchste Ca2+ – Konzentration, die durch Ionomycin stimuliert wurde, wurde als 100% verwendet, um die durch CCL21 induzierte Calciumantwort zu normalisieren., Der EC50 wurde in GraphPad durch Anpassen einer nichtlinearen Dosis-Wirkungs–Kurve mit drei Parametern geschätzt.
Immunpräzipitation und Western Blotting
Frisch isolierte Maus–B−Zellen aus GPR174-GFP BAC transgenen Mäusen wurden mit 10 µg ml−1 F(ab‘)2 Ziegen-Anti−Maus-IgM und 10 µg ml-1 Anti-CD40 für 48 h aktiviert. Diese aktivierten B-Zellen wurden dann bei 2 × 107 Zellen pro Milliliter in RPMI-Medium, das 1% FBS enthielt, suspendiert und unbehandelt oder stimuliert mit 300 ng ml-1 CCL21 bei 37 °C für 30 min. B-Zellen wurden dann sofort analysieren in 1% NP-40 lysis buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% Glycerin und protease-Inhibitoren). Zur Immunpräzipitation von GFP-markiertem GPR174 wurden Lysate von 108 B–Zellen über Nacht mit 20 µl GFP-Trap-Beads (ChromoTek) inkubiert. Nach wiederholten Waschungen wurden Immunpräzipitate durch Inkubation in 0,2 M Glycinpuffer (pH 3,0) für 10 min bei Raumtemperatur eluiert und anschließend mit 1 M Tris-HCl (pH 8,5) neutralisiert. Proteine wurden durch SDS–PAGE getrennt und auf die Polyvinylidenmembran (Millipore) übertragen. Membranen wurden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung blockiert, die 5% BSA und 0,1% Tween 20 enthielt., Um zu erkennen, Ziel-Moleküle durch immunoblotting, die wir verwendet, Kaninchen-anti-GFP (Abcam), Kaninchen-anti-Gai-1 (Abcam), Kaninchen-anti-Gai-2 (Abcam) und Kaninchen-anti-Ga13 (Abcam) – Antikörper. HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper wurde von Bioeasytech gekauft. Immunoblots wurden mittels verbesserter Chemilumineszenz (Thermo Fisher Scientific) nachgewiesen und Bilder mit ImageJ-Software analysiert.
Quantitative PCR
Zellen gewünschter Typen wurden mit einer FACSAria III sortiert und einer Gesamt-RNA-Extraktion mit dem RNeasy Plus Mini oder Micro Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen., RNA wurde die reverse-Transkription mit All-In-One-RT-MasterMix (Abm). Quantitative PCR wurde durchgeführt mit qPCR MasterMix (Abm) auf einem 7500 Real-Time-PCR-system (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., Die relative Expression von Zielgenen unter verschiedenen Proben wurde nach Normalisierung mit der Expression der Zielgene Actb oder Gapdh verglichen.
Statistische Datenanalyse
Statistiken und Grafiken wurden in Prism (Graphpad) durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die T-Tests des zweischwänzigen ungepaarten Schülers verwendet, um Endpunktmittel verschiedener Gruppen zu vergleichen.
Berichtszusammenfassung
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Papier verknüpft ist.