Was Ist die Sanger-Sequenzierung?
Die Sanger-Sequenzierung, auch bekannt als „Chain termination method“, wurde 1977 vom englischen Biochemiker Frederick Sanger und seinen Kollegen entwickelt. Diese Methode dient zur Bestimmung der Sequenz von Nukleotidbasen in einem DNA-Stück (üblicherweise weniger als 1.000 bp lang). Die Sanger-Sequenzierung mit 99.,99% Basengenauigkeit gilt als „Goldstandard“ für die Validierung von DNA-Sequenzen, einschließlich derjenigen, die bereits durch Next-Generation Sequencing (NGS) sequenziert wurden. Die Sanger-Sequenzierung wurde im Human Genome Project verwendet, um die Sequenzen relativ kleiner Fragmente menschlicher DNA (900 bp oder weniger) zu bestimmen. Diese Fragmente wurden verwendet, um größere DNA-Fragmente und schließlich ganze Chromosomen zusammenzusetzen.
Sanger Sequencing VS NGS
Die Entwicklung von NGS-Technologien hat die Genomforschung beschleunigt. NGS können gleichzeitig mehr als 100 Gene und ganze Genome mit Low-Input-DNA sequenzieren., Die Sanger-Sequenzierung ist nach wie vor weit verbreitet im Bereich der Sequenzierung, da sie mehrere herausragende Vorteile bietet: (i) Kosteneffizienz für die Sequenzierung einzelner Gene und (ii) Genauigkeit von 99,99%, insbesondere geeignet für die Verifikationssequenzierung für standortgerichtete Mutagenese oder geklonte Inserts.
Wie funktioniert Sanger Sequencing?
In der Sanger-Sequenzierung wird ein DNA-Primer verwendet, der komplementär zur Schablonen-DNA (der zu sequenzierenden DNA) ist, um ein Ausgangspunkt für die DNA-Synthese zu sein., In Gegenwart der vier Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs: A, G, C und T) erweitert die Polymerase den Primer durch Zugabe des komplementären dNTP zum Schablonen-DNA-Strang. Um zu bestimmen, welches Nukleotid in die Nukleotidkette eingebaut ist, werden vier Dideoxynukleotidtriphosphate (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP und ddTTP), die mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind, verwendet, um die Synthesereaktion zu beenden. Im Vergleich zu dNTPs hat ddNTPs ein Sauerstoffatom aus dem Ribonukleotid entfernt, daher kann keine Verbindung mit dem nächsten Nukleotid bilden., Im Anschluss an die Synthese werden die Reaktionsprodukte in vier Bahnen eines einzelnen Gels in Abhängigkeit von dem vielfältigen Kettenabschlussnukleotid geladen und einer Gelelektrophorese unterzogen. Entsprechend ihrer Größe wird somit die Sequenz der DNA bestimmt.
Abbildung 1. Die Struktur von ddNTP und dNTP.
Bildnachweis:“ Whole-genome Sequencing: Abbildung 1, “ von OpenStax College, Biologie).,
Sanger-Sequenzierungsschritte
Die Sanger-Sequenzierungsmethode besteht aus 6 Schritten:
(1) Die doppelsträngige DNA (dsDNA) wird in zwei einzelsträngige DNA (ssDNA) denaturiert.
(2) Eine Grundierung, die einem Ende der Sequenz entspricht, ist angebracht.
(3) Vier Polymerase-Lösungen mit vier Arten von dNTPs, aber nur eine Art von ddNTP hinzugefügt.
(4) Die DNA-Synthesereaktion initiiert und die Kette erstreckt sich, bis ein Endnukleotid zufällig eingebaut wird.
(5) Die resultierenden DNA-Fragmente werden zu ssDNA denaturiert.,
(6) Die denaturierten Fragmente werden durch Gelelektrophorese getrennt und die Sequenz bestimmt.
Abbildung 2. Die Sanger-Sequenzierungsmethode in 6 Schritten (angepasst von Gauthier 2008).