Wir haben vor kurzem verwendet CRISPR zu stören, die Kras-Onkogen in zwei unabhängige Lungen-Adenokarzinom-Zelllinien , die abgeleitet wurden aus Kras G12D; p53 fl/fl (KP) Mäuse . Wir isolierten zwei einzellige Klone, die jeweils Frameshifting-Deletionen in Exon 2 trugen (Abb., 1a und zusätzliche Datei 1: Abbildung S1a): KP1 trägt eine 2-nt „-CG“ – Löschung im G12D-Allel und eine 1-nt“-C „-Löschung im ansonsten Wildtyp (WT) Kras-Allel; und KP2 trägt eine 2-nt“ – GG “ – Löschung. Keiner der Klone produziert Kras-Protein in voller Länge, was darauf hinweist, dass alle drei Löschungen den Kras-Leserahmen stören.
sgRNA-targeting-Kras induziert exon-skipping in single cell clones. ein Schema einer sgRNA, die auf Exon 2 des Maus-Kras-Gens (sgKras) abzielt., Die rote Pfeilspitze bezeichnet die Cas9-Spaltstelle. KP1-und KP2-Zelllinien wurden mit Lentivirus transformiert, das Cas9 und sgKras kodiert. Zwei einzellige Klone (KP1-Klon und KP2-Klon) beherbergen Frameshift-Löschungen. Schwarze Pfeile zeigen die Positionen von RT-PCR-Primern (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) an. Die G12D-codon ist Unterstrichen. b Normalisierte Kras lesen Zählungen aus der RNA-Sequenzierung (RNA-seq) Analyse von KP-Elternzellen (blau) und KP-Klonen (rot). RNA-seq wurde zweimal für den KP2-Klon und dreimal für die anderen Gruppen durchgeführt. „+“bezeichnet ein Allel., c RNA-seq zeigt partielles Exon 2-Überspringen in KP1-Klonen. RNA-seq-Zahlen zeigen Lesevorgänge an, die sich über die angegebenen Exon-Kreuzungen erstrecken. Zwei repräsentative biologische Replikate werden gezeigt. d RT-PCR-Analyse von Kras-mRNA erkennt ein exon 2 übersprungen band. Die erwarteten Bandgrößen sind 331 bp und 209 bp. M, molekulare marker. „*“bezeichnet Indels in PCR-Produkten von Klonen. e Streudiagramm mit 22 Exon-Ereignissen, die sich sowohl in KP1-als auch in KP2-Klonen ändern. Der Ausschluss von Kras exon 2 ist das häufigste Ereignis., Ψ, Prozentualer Spleißindex
Frameshift-Mutationen in frühen Exons lösen bekanntermaßen unsinnvermittelten Zerfall (NMD) aus , wodurch mRNAs mit vorzeitigen Abbruchcodons eliminiert werden. Bei der Analyse von mRNA-Sequenzierungsdaten (RNA-seq) stellten wir jedoch fest, dass die offensichtlichen Kras-mRNA-Spiegel (dh die gesamten normalisierten mRNA-Lesevorgänge) in KP1-Zellen nur um 19% und in KP2-Zellen um 47% reduziert waren.im Vergleich zu Eltern-KP-Zellen (Abb. 1b). Beide Klone produzierten weniger Exon – 2-Lesevorgänge, aber normale Exon-1-und 3-Lesevorgänge (Abb., 1c), was darauf hindeutet, dass Exon 2 in den Klonen KP1 und KP2 übersprungen werden könnte. In der Tat haben wir Exon 1-3 Junction Reads erkannt, was darauf hinweist, dass Exon 2 übersprungen wurde (Abb. 1c und Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1b). Bei der Berechnung des Verhältnisses zwischen Exon 2-Lese-und Gesamtlesewerten haben wir festgestellt, dass Exon 2 nur in 64,0 ± 9,1% der Kras-Lesevorgänge aus KP1-Clone enthalten ist (Abb. 1c und Tabelle 1). Ähnliches Exon 2-Überspringen wurde in KP2-Klonen beobachtet (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1c)., Gleichzeitig ergab die umgekehrte Transkription von Kras-mRNA, gefolgt von einer Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), zwei Produkte: Eines entsprach intakter Kras-komplementärer DNA (cDNA) und das andere entsprach der Exon 1-3-Isoform (Abb. 1d). Die Isoform exon 1-3 behält einen partiellen offenen Kras-Leserahmen bei, der die Übersetzung von einem ATG-Codon in Exon 3 initiieren könnte (zusätzliche Datei 1: Abbildung S2) und ein stark abgeschnittenes Kras-Protein erzeugt.,
Die Bearbeitung von Kras induzierte keine alternative spleißgenomweite. Wir identifizierten 97 alternativ gespleißte Exons in KP1-Zellen und 177 Ereignisse in KP2-Zellen. KP1-und KP2-Klone teilten 22 Kassetteneinschluss-oder Ausschlussereignisse, wobei der Ausschluss von Kras Exon 2 die größte Veränderung in beiden Klonen darstellt (Abb. 1e und Zusätzliche Datei 1: Tabelle S3). Somit induzierte die Bearbeitung von Kras exon 2 spezifisch das Überspringen von Kras exon 2., Während Maus-Kras-G12D-Transkripte (GGU zu GAU) Exon 2 in elterlichen KP-Zellen nicht überspringen, fanden wir heraus, dass ~15% der menschlichen KRAS-G12S-Transkripte (Codon 12 GGU zu AGU) Exon 2 in der A549-Linie für humane Lungenkrebszellen überspringen (zusätzliche Datei 1: Abbildung S1d). Wir konnten den Gewinn oder Verlust von Exon-Spleißverstärkern oder-Schalldämpfern nicht vorhersagen , aber unsere Daten legen nahe, dass Sequenzen in der Nähe von Kras-Codon 12 die Exon-2-Aufnahme in Maus-und menschliches Kras fördern. Das durch CRISPR-Bearbeitung induzierte Exon-Skipping war nicht auf Kras oder Maus-KP-Zellen beschränkt., Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die CRISPR-Bearbeitung von FLOT1 Exon 3 in HeLa-Zellen das Überspringen von Exon 3, Exon 4 oder Exons 3, 4 und 5 verursachen kann . Wir haben auch ein seltenes Exon-Skipping festgestellt, als wir Exon 11 von LMNA in menschlichen HCT116-Zellen zielten (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S3). Das Überspringen von LMNA Exon 11 erzeugt ein In-Frame-Transkript, das in ein neomorphes Protein übersetzt werden könnte.
Um die Idee, dass Exon-Skipping ein funktionelles In-Frame-Transkript erzeugen könnte, weiter zu untersuchen, fragten wir, ob CRISPR-vermittelte Bearbeitung von Ctnnb1 exon 3 Exon-Skipping induzieren und einen Gain-of-Funktion-Phänotyp verursachen könnte., Exon 3 von Ctnnb1 kodiert Phosphoakzeptorreste, die den Abbau des β-Catenin-Transkriptionsfaktors fördern ; genetische Exzision von Ctnnb1 Exon 3—das in Verbindung mit Exon 4 steht-stabilisiert ein konstitutiv aktives β-Catenin, das sich im Kern ansammelt . Wir entwarfen 11 sgRNAs, die auf Regionen entlang Ctnnb1 exon 3 (Ctnnb1-sg1 bis-sg11) abzielen, einzelne sgRNAs in KP-Zellen transduzierten und mithilfe der Hochdurchsatzsequenzierung das Ausmaß der Bearbeitung an der sgRNA-Zielstelle in jeder Zeile analysierten (Abb. 2b x-Achse, Zusätzliche Datei 1: Abbildung S4 und zusätzliche Datei 2: Tabelle S4)., Drei sgRNAs (sg6, sg9 und sg10) zielten ineffizient auf Ctnnb1 ab. Acht der Ctnnb1-sgRNAs (sg1 bis sg5, sg7, sg8 und sg11) induzierten jedoch Indels an ihren Zielstandorten mit Frequenzen, die 20% überstiegen. Beispielsweise erzeugte Ctnnb1-sg1 + T-Einfügungen in etwa 65% der Lesevorgänge (Abb. 2c). In jeder Population, auf die eine starke Ctnnb1-sgRNA abzielt, haben wir drei RT-PCR-Produkte nachgewiesen, die Exons 2 bis 5 umfassen (Abb. 2d). Das Hauptprodukt entspricht dem normalerweise gespleißten Transkript, das Exon 3 enthält. Die anderen beiden Produkte entsprechen alternativ gespleißten Transkripten: eines, das exon 3 überspringt (dh, exon 2-4 Spleißen, Abb. 2e) und eine, die beide Exons 3 und 4 überspringt (dh Exon 2-5 Spleißen, Abb. 2f). Ctnnb1 sgRNAs, die entweder auf DNA-stranginduziertes Exon-Skipping abzielen, und Cas9-Nukleaseaktivität waren für das Exon-Skipping essentiell (Abb. 3a).
Ctnnb1 sgRNAs targeting-exon-3 induziert exon-skipping. ein Schema des Ctnnb1-Gens. Das In-Frame-Exon 3 kodiert für eine inhibitorische Domäne: Phosphorylierungsaminosäuren 33, 37, 41 und 45 fördern den Abbau des β-Catenin-Proteins., Verlust von exon 3 stabilisiert β-Catenin. Elf sgRNAs wurden für Exon 3 entwickelt: starke sgRNAs in Rot bzw. schwache sgRNAs in Schwarz. sgRNAs, die „NGG“ PAM verwenden, werden oben Exon 3 und diejenigen, die „CCN“ PAM verwenden, unten Exon 3 gezeigt. b Korrelation zwischen exon 3 skipping und sgRNA Effizienz. Genomische Indels wurden durch tiefe Sequenzierung gemessen. KP-Zellen wurden mit Lentivirus infiziert. Exon 3 Übersprungeffizienzen sind von (d). Indels von sg11 wurden nicht bestimmt. sgRNAs, die > 20% indels induzieren, sind rot markiert., c-Verteilung von sg1 Indels zeigt, dass eine T-Insertion (+T) an der Cas9-Spaltstelle Nukleotid 97 von Exon 3 (rote Pfeilspitze) am häufigsten war. Die Sequenz ist in blau. d RT-PCR mit Primern über Exons 2 und 5 zeigt partielles Exon-Skipping. M molekularer marker. sgGFP ist eine Kontrolle sgRNA. Exon 3-Übersprungbänder wurden mit der ImageQuant TL-Software quantifiziert und auf cDNA-Bänder in voller Länge normalisiert. sg4 zeigte sichtbare schwache Bänder, die nicht quantifiziert werden konnten., e, f TOPO-Klonen und Sanger-Sequenzierung bestätigten, dass die beiden großen unteren RT-PCR-Bänder in (c) alternatives Spleißen von Exon 2-4 bzw. g Western-Blot-Analyse von β-Catenin. Volle Länge β-Catenin ist ~86 kD. β-Catenin ohne exon 3 (delta-exon-3) ~77 kDa. Aktin diente als Ladekontrolle
Cas9-nuklease-Aktivität erforderlich für das überspringen eines oder mehrerer exons., eine RT-PCR-Analyse der Ctnnb1-mRNA in KP-Zellen, transformiert mit Lentiviren, die sgCtnnb1.2 und Nuclease-defektes Cas9 (dCas9), dCas9-KRAB Fusion oder WT Cas9 kodieren. RT-PCR wurde unter Verwendung von Primern in Exons 2 und 7 an transduzierten KP-Zellpopulationen nach Puromycinselektion und FACS-Sortierung durchgeführt. Die Exon-Länge und Leserahmenphase werden angezeigt. Nur das Exon 2-4-Spleißprodukt behält eine β-Catenin-Codierungssequenz im Rahmen bei. b RT-PCR-Analyse von Ctnnb1 mRNA in KP-Zellen transduziert mit Lentiviren, die Cas9 und sgGFP kodieren, sg3, oder sg5., „- „, unbehandelt
Die Western-Blot-Analyse ergab, dass mit den starken sgRNAs transduzierte Zellpopulationen ein kleineres ~74 kD β-Catenin-Protein produzieren, dessen Größe der des Exon 2-4-Spleißprodukts entspricht (Abb. 2g). Das β-Catenin-Protein in voller Länge war vier Tage nach der Transduktion nicht signifikant erschöpft. Um zu testen, ob das alternative Spleißen von der kontinuierlichen Expression von Cas9 oder sgRNA in den lentiviralen Vektoren abhängt, haben wir Cas9 und Ctnnb1-sg1 oder eine Nicht-Targeting-sgRNA-Kontrolle co-transfektiert., Sieben Tage nach der Transfektion, wenn transfizierte Cas9-und Guide-RNAs erschöpft sein sollten, untersuchten wir die β-Catenin-Lokalisation durch Immunfluoreszenz. In Mausfibroblastenzellen, die mit einer Nicht-Targeting-Kontrollsgrna transfektiert wurden, lokalisierte β-Catenin Zellübergänge (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5a). Im Gegensatz dazu haben wir in vielen mit Ctnnb1-sg1 transfizierten Zellen β-Catenin im Kern nachgewiesen (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S5a)., Diese Ergebnisse legen nahe, dass für das Exon-Überspringen keine kontinuierliche Bearbeitung erforderlich ist und dass das durch CRISPR-vermittelte Überspringen von Exon 3 induzierte Exon 3-Überspringen von Ctnnb1 exon 3 eine Funktionsverstärkung β-Catenin-Isoform erzeugt.
Wir analysierten weiter Transkripte von Exonen 2 bis 7 in Zellpopulationen, die mit Ctnnb1-sg2,- sg3 und-sg5 behandelt wurden. Zusätzlich zur Isoform in voller Länge haben wir vier Transkripte entdeckt, bei denen Exon 2 anscheinend an jedes stromabwärts liegende Exon gespleißt wurde (d. H. Exon 2-4, Exon 2-5, Exon 2-6 und Exon 2-7; Abb. 3a, b)., Wir verstehen weder den Mechanismus dieses scheinbar promiskuitiven Exon-Skipping, das durch Ctnnb1 Exon 3-Editing induziert wird, noch konnten wir promiskuitives Exon-Skipping mit bestimmten Zielstellen oder Indel-Mutationen in Exon 3 korrelieren. Trotzdem haben wir einen Ctnnb1-sg3-editierten Klon isoliert, der auf einen möglichen Mechanismus hindeutet (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S6a). Dieser biallelische Klon enthält eine 3-bp-In-Frame-Löschung auf einem Allel und eine große 832-bp-Löschung auf dem anderen; Die 832-bp-Löschung verschmilzt das 5′ – Ende von Intron 2 mit dem 3′ – Ende von Exon 4 (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S6)., Wir haben zwei Transkripte in diesen Zellen gefunden: das ordnungsgemäß gespleißte Transkript, das die 3-bp-Löschung enthält, und ein Transkript, das Intron 2 enthält, das mit Exon 4 verschmolzen ist (zusätzliche Datei 1: Abbildung S6c und Tabelle 1). Diese Ergebnisse legen nahe, dass scheinbares Exon-Skipping, das in Populationen bearbeiteter Zellen nachgewiesen wurde, Genomumlagerungen widerspiegeln könnte, die Exons entfernen.
Zwei Experimente unterstützen die Idee, dass eine einzelne sgRNA große genomische Deletionen induzieren kann, die Exons entfernen., Zum Beispiel isolierten wir 15 Klone aus Maus-3T3-Zellen, die vorübergehend mit Cas9 und Ctnnb1-sg1 transferiert wurden, und fanden heraus, dass vier Klone (dh Klone 4, 5, 13 und 15) ein offensichtliches Exon-Überspringen durch RT-PCR zeigten. Die genomische PCR zeigte Genomumlagerungen in drei dieser Klone: große Löschungen (>500 bp) und kleinere Löschungen (~100 bp) in Klonen 4 und 15 sowie große Einfügungen in Klonen 13 und 15 (zusätzliche Datei 1: Abbildung S7)., Nachdem wir Exon 6 von p65/RelA ins Visier genommen hatten, isolierten wir einen biallelischen p65-Klon (#15): Ein Allel enthält eine 1-nt „+A“-Einfügung und das andere eine 2268–bp-Löschung, die die Exons 5, 6 und 7 entfernt (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S8a, c-e). In p65 clone #15 haben wir das vollständig gespleißte Transkript und ein exon 4-8 Spleißprodukt erkannt (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S8c). Beide Allele codieren Frameshifted-Transkripte und beide p65-Transkripte befinden sich auf niedrigeren Ebenen als WT (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S8b)., Wir haben auch einen bearbeiteten p65-Klon (#31) homozygot für die gleiche + A-Insertion wie in Clone #15 isoliert, aber Clone #31 erzeugt keine alternativ gespleißten Transkripte. Somit ergibt sich das exon 4-8 spliced Transkript in clone #15 aus dem Löschen der Exons 5, 6 und 7. Diese großen Exon-Löschereignisse waren unerwartet und würden mit typischen PCR-basierten Screening-Assays übersehen.,
Die Fähigkeit, eine Gain-of-Function-Aktivität durch Induzieren von Exon-Skipping oder Exon-Exzision zu verursachen, deutete darauf hin, dass CRISPR-meditierte Bearbeitung mit einer einzigen sgRNA ein nützlicher Weg sein könnte, um teilweise zu retten Funktion zu einem Krankheitsgen, das eine Rettung auf niedriger Ebene erfordert. CRISPR-vermittelte homologe DNA-Reparatur wurde verwendet, um vorzeitige Stop-Codon-Mutationen im Dmd-Gen in einem Mausmodell von DMD zu korrigieren, und mehrere Gruppen haben CRISPR verwendet, um Dmd-Exons zu löschen und die Dmd-Expression teilweise wiederherzustellen . Wir haben vier sgRNA/Cas9-Lentiviren entwickelt, die auf verschiedene Stellen im Exon 23 des Dmd-Gens abzielen (Abb., 4a, b) und transduzierte Maus-C2C12-Myoblasten, eine Zelllinie, die häufig als Modell für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) verwendet wird . In C2C12-Zellen, die mit Dmd sgRNAs transduziert wurden, haben wir ein RT-PCR-Produkt nachgewiesen, das dem normalen Spleißprodukt entspricht, das Exon 23 enthält. Die Sequenzierung dieser RT-PCR-Produkte ergab, dass nur Dmd-sg2 Dmd exon 23 effizient bearbeitete, was durch gemischte Sequenzspitzen jenseits der sgRNA-Zielstelle belegt wurde (zusätzliche Datei 1: Abbildung S9). In Zellen, die mit Dmd-sg2 transduziert wurden, detektierten wir auch ein RT-PCR-Produkt entsprechend Exon 22, das zu Exon 24 gespleißt wurde (Abb. 4c, d)., Daher könnte das Targeting von Exon 23 mit einer sgRNA ausreichen, um ein partielles Exon-Skipping zu induzieren und einen intakten offenen Leserahmen von Dystrophin zu erzeugen. DMD ist ein klassisches Beispiel für eine Krankheit, bei der eine geringe Menge an funktioneller Wiederherstellung einen erheblichen klinischen Nutzen bieten kann .
Eine sgRNA, die auf Exon 23 von Dmd abzielt, kann dystrophische mRNA im Rahmen teilweise wiederherstellen. ein Schema der sgRNA Targeting und Skipping von Maus Dmd exon 23 und Lage der Primer für RT-PCR-Analyse., Das Überspringen von Exon 23 erzeugt In-Frame-mRNA. b sgRNA-Zielstellen in Dmd exon 23. c RT-PCR-Analyse von C2C12-Maus-Myoblastzellen, transformiert mit Lentiviren, die Cas9 und sgDmd1, 2, 3 oder 4 kodieren. Die erwarteten Bandgrößen sind 353 bp und 140 bp. M molekularer marker. d Sequenzanalyse des 140-bp-cDNA-Bandes aus sgDmd2-behandelten Zellen bestätigte Spleißen von exon 22 zu exon 24