Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., A gpr174-hiányos egereket szabványos géncélzó eljárásokkal hozták létre, hogy a Gpr174 nyílt olvasási keretet LacZ/neo kazettával helyettesítsék az 129svevbrd embrionális őssejtvonal segítségével (Texas A&M genomikai Orvostudományi Intézet, TG0128). Ezek a GPR174-hiányos egerek 12 generáción át c57bl/6 egerekbe kerültek. A c57bl/6 háttéren lévő releváns egerek GFP-expresszáló MD4 egerekhez és dsRed-expresszáló GPR174-elegendő vagy hiányos MD4 egerekhez kerültek., Kísérletekhez a 6-12 hetes korú és a jelzett nemű szemeteseket használták. Az egérkísérletek mintaméreteit empirikusan határozták meg, az egereket pedig véletlenszerűen rendelték kontroll-vagy kísérleti csoportba. Az itt bemutatott egérkísérletekhez nem volt szükség vakításra. Az egereket specifikus kórokozóktól mentes körülmények között tartották fenn, és a kormányzati és Tsinghua intézményi állatgondozási és állatjóléti bizottsági iránymutatásoknak megfelelően alkalmazták őket.,
GPR174–GFP BAC transzgenikus egerek
kódoló Szekvenciák a glicin–glicin–glicin–szerin (GGGS) linker (négyszer), valamint a fokozott GFP (EGFP) ki azonnal, mielőtt a stop kodon a GPR174 olvasási keret az egér BAC klón RP23-206J14 által homológ rekombináció. A módosított BAC-ot megtisztították és mikroszinjektálták a megtermékenyített petesejtek pronukleájába, hogy transzgenikus riportereket hozzanak létre. Az alapító egeret, amelyet a vérben lévő GFP-expresszáló B-sejtek szempontjából pozitívnak vizsgáltak, B6 egerekkel tovább tenyésztették a GPR174-GFP Bac törzs létrehozásához.,
sejtkultúra, retrovírus és in vitro transzdukció
naiv t-vagy B-sejteket izoláltunk a negatív CD4 T-sejt izolációs készlet vagy a naiv B-sejt izolációs készlet (Miltényi Biotec) segítségével a gyártó protokolljai szerint. Hogy mutattak fokozott target gének a B-sejtek, tisztított B sejtek aktív 1 µg ml−1 lipopolysaccharide (Sigma) 1 nap előtt, hogy a spin-fertőzöttek antiretrovirális supernatants 1500 g 2 h, mint described18.
csontvelő kimérák építése
B6 recipiens egerek halálosan besugárzottak röntgensugárral (5.,5 Gy, kétszer), majd intravénás transzfert kapott 3 × 106 nem-párosított csontvelősejtből, amely 80% µMT sejtekből és 20% gpr174-elegendő vagy hiányos sejtekből áll. A kimérákat a feloldás után hat-nyolc héttel kísérletekhez használták.
Gonadectomia
az elválasztást követően egereken avertint (2, 5%, 0, 015 ml g−1 testtömeg) intraperitoneálisan altatták. A nőstény egerek ovariectomiájához mindkét oldalon petefészkeket fedeztek fel, majd kétoldali háti bemetszésekkel távolították el., Hím egerekben végzett orchidectomia esetén medián hasi bemetszést végeztek a herék mindkét oldalán történő feltárására és eltávolítására. Ál-operált kontroll egerek műtéten estek át, beleértve a kétoldali háti bemetszéseket vagy a középső hasi bemetszést petefészkek vagy herék eltávolítása nélkül. Sebészeti sebnyílásokat varrtak, antibiotikumokat és fájdalomcsillapítókat pedig helyileg alkalmaztak. Az egereket nyolc héttel a későbbi kísérletek előtt engedték vissza.,
tesztoszteron kezelés
a hat-nyolc hetes egereket szubkután injekciózták tesztoszteronnal (10 mg kg-1 testtömeg), amelyet napraforgómagolajban oldottak kéthetente minden második napon. A járművezérlő egereket kizárólag napraforgómagolajjal kezelték.
Örökbefogadó, immunizálás, illetve vírusos fertőzés
mérésére magzati-központ formáció által MD4 B sejtek, 105 ÓSZ-i-II-T a sejteket, illetve, 5 × 105 MD4 B sejtek feltüntetett genotípusok volt intravénásan át a férfi B6 címzettjei, amelyeket később immunizált subcutan 0-val.,5 µg lipopoliszacharid és 30 µg HEL–OVA konjugált antigén alumban (Thermo Scientific). A HEL–OVA kémiai térhálósítással készült Hidralink konjugációs készlettel (SoluLink), amint azt korábban leírták19. Intézkedés magzati-központ kialakulása, válaszul SRBC immunizálás vagy lymphocytás choriomeningitis vírus (LCMV) fertőzés, egerek voltak beadni hasüregébe 5 × 108 SRBCs (a Z. Baiji) vagy 2 × 105 emléktábla-képző egység a LCMV Armstrong vírus (L. Ye R. Ahmed).,
EAE by MOG protein immunization
az emberi MOG első 120 aminosavát kódoló szekvenciát az emberi agy komplementer DNS könyvtárából származó polimeráz láncreakcióval (PCR) erősítették, és a pET22b+ expressziós vektor (Novagen) NdeI és XhoI helyei között klónozták. A humán MOG fehérjét BL21(DE3) Escherichia coli-ban fejezték ki, és karboxi-terminális hisztidin (His) címkéjével tisztították. A fehérje tisztaságát és koncentrációját az SDS–PAGE, illetve a bicinchoninsav (BCA) fehérje teszttel értékelték. A rekombináns fehérjéket -80 °C-on tárolták a felhasználásig., Hogy rábírja EAE, csontvelő-kiméra állatok megjelölt típusok immunizált subcutan a szárny 200 µg rekombináns humán MOG fehérje: legalább a teljes Freund az adjuváns napján 0-ra. Az egereket intravénásan 200 ng pertussis toxinnal (Invitrogén) injektálták a 0.és 2. napon. Az egereket az 1. naptól kezdve vak módon figyelték meg a betegség progressziója szempontjából. A betegség súlyosságát a következőképpen pontozták: 0, nincsenek klinikai tünetek; 1, megbénult farok; 2, a hátsó végtagok összehangolt mozgásának és parézisének elvesztése; 2.5, egy hátsó végtag bénulása; 3, mindkét hátsó végtag bénulása; 3.,5, mind a hátsó végtagok bénulása, mind az elülső végtagok gyengesége; 4, mellső végtagok bénulása; és 5, moribund. A betegség súlyosságának összehasonlításához kísérletenként tíz egeret vizsgáltunk, és a kétirányú ANOVÁVAL idővel elemeztük a betegség pontszámait.
citometria
Mérése antigén-specifikus antitest-titer
mérésére SRBC-specifikus antitest-titer, akkor feloldódik 5 × 108 SRBCs 1 ml kétszer desztillált vízben, majd centrifugált őket 15.000 r.p.m. 20 perc., A pelletet PBS-ben reszuszpendálták, és a MaxiSorp enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati (ELISA) lemezek (nunc Maxisorp) 4 °C-os éjszakai bevonására használták.a MOG-specifikus szérum antitestek méréséhez 2 µg ml−1 tisztított rekombináns humán MOG-ot használtunk az ELISA lemezek bevonására. A nemspecifikus kötődést 1% szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) blokkolták PBS-ben, Tween-20-mal (PBST) 2 órán keresztül 37 °C-on, majd 2× soros immunizált egerek szérummintáinak inkubálásával 1 órán át 37 °C-on., Lemezek voltak, mosott, majd inkubáljuk torma-peroxidáz (HRP)-konjugált anti-egér IgG másodlagos antitest (1/20,000) 1 h 37 °C-on Lemezek voltak mosva, kifejlesztett 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), majd megállt, 1 M HCl. Az üres kutakat nullának állítottuk be, az abszorbanciát pedig 450 nm-en rögzítettük. Negatív kontrollként a nem immunizált egerek szérumait használtuk; a cut-off érték a negatív kontroll 450 nm-es (OD450) optikai sűrűsége volt, szorozva 2.1-gyel. Egy olyan kút, amelynek OD450 értéke nem kevesebb, mint a cut-off érték, pozitívnak tekinthető., A minta legmagasabb hígítása, amely pozitivitást adott, a minta titere.
megoszlása a B-sejtek által immunhisztokémiai
A különböző kísérletek, naív B-sejt, B-sejtek aktív 1 h 10 µg ml−1 F(ab’)2 kecske anti-egér IgM (Jackson Immunoresearch), vagy a B-sejtek transduced a retrovírus kerültek át B6 címzettnek. Szükség esetén ezeket a sejteket 1 µM tetrametilrhodamin (TAMRA), 4-klórmetil-6,8-difluor-7-hidroxi-kumarin (CMF2HC) vagy 5-klórmetilfluoreszcein-diacetát (CMFDA) (Invitrogén) címkével látták el., A lép vagy inguinalis nyirokcsomók a címzett egerek fix 1% paraformaldehidet 12 h majd kiszáradt 30% szacharóz oldat 12 h 4 °C. biztosítja A maximális képviselete különböző szerv régiók a végső adatbázis, mi feldolgozott megesett szövettani metszetek, valamint festett őket jelzett antitest. A festési reagensek közé tartozott az eFluor450-IgD (eBioscience), az APC-CD35 (BD), a PE-CD3 (BD), az eFluor450-B220 (eBioscience), a rabbit anti-GFP (abcam) és az AF488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen)., A csúszdákat a ProlongGold Antifade reagenssel (Invitrogen) szerelték fel, és Olympus FV1000 függőleges mikroszkóppal vizsgálták. A képeket az Imaris (Bitplane) és az ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health) segítségével elemezték.
Lép stroma készítmény
a Lép a egerek, a patkányok vagy a disznók gombot nyomva tartva föld ellen, fém háló kiadás vörösvértestek és limfociták. A fennmaradó unsuspendable, amorphic stroma szöveti elemek alaposan mossuk PBS előtt elhelyezett B27 szérum-szabad kultúra közepes (Invitrogen), valamint keresztül 37 °C-on 12 óra., Egereknél három állat stromális elemeit 1 ml-es közegben tenyésztették. Sertések esetében az 1 lépből származó stromális elemeket 80 ml-ben tenyésztették. A kapott tenyészetet 10 000 r.p.m-en centrifugáltuk 60 percig, hogy megkapjuk a kondicionált közeget, amelyet vagy azonnal kísérletekhez használtak, vagy -20 °C-on fagyasztották használatig.
Transwell assay
B az 1 µg ml−1 lipopoliszachariddal aktivált B sejteket 60 órán át alkalmazták a biokémiai frakcionálásból származó különböző frakciók vizsgálatára., A ccl21 által indukált migráció vizsgálatára naiv B−vagy B-sejteket, amelyeket 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat anti-egér IgM (Jackson Immunoresearch) és 10 µg ml-1 anti-CD40 (clone FGK4.5, Bio X Cell) aktiváltak. Amikor a B-sejtek különböző genotípusok hasonlították össze, legalább három donor egerek minden genotípus kezelés használták elkülöníteni a B sejtek minden kísérlet, valamint kapun voltak mindig. A B sejteket milliliterenként 106 sejtben szuszpendáltuk, és 1 órán át 1% FBS-t tartalmazó rpmi közegben pihentettük 37 °C-on., Ezután összesen 100 µl cellás szuszpenziót adtak a felső kamrához egy 5 µm-es pórusú Transwellben (Corning Costar), és összesen 150 µl vonzószert tartalmazó oldatot adtak az alsó kamrához. Ezeket a megoldásokat tartalmazza kultúra közepes vel a nyers egér lép stroma készítmény, kultúra közepes vel a nyers sertés lép stroma készítmény, elúciós frakciók a kromatográfia, kultúra tartalmazó adathordozó rekombináns CCL21, valamint CCL19 (Peprotech), vagy 18/0 LysoPS (Avanti Polar Lipidek) a jelzett koncentrációt., Egyes kísérletek, egér stroma-vel közepes volt az első, kiegészítve egy végső koncentrációja 5 µg ml−1 semlegesítő antitestek ellen egér CCL21 vagy CCL19 (R&D rendszer), vagy a kecske IgG isotype-ellenőrzési, valamint keresztül 4 °C-on 3 óra használat előtt a transwell vizsgálat. Az antitest dózis legalább elegendő volt a 100 ng ml−1 CCL21 vagy CCL19 semlegesítéséhez, az előzetes kísérletekben meghatározottak szerint. A sejteket 3 órán át 37 °C-on inkubátorban engedték át., Az alsó kutakba vándorolt sejteket áramlási citometriával sorolták fel, az ismert számok fluoreszkáló A20 sejtjeit közvetlenül az olvasás előtt adták hozzá, mint belső számlálási szabványt. Minden feltétel mérése három példányban kutak, hacsak másként nem jelezzük.
biokémiai frakcionálás
a kromatográfiát egy ÄKTApurifer 10 fast protein liquid chromatography (FPLC) rendszerrel (GE Healthcare) végeztük 4 °C-on, az utolsó lépés kivételével, amelyet ÄKTAmicro FPLC rendszerrel (GE Healthc) végeztünk., Összesen 1200 ml sertés stroma-kondicionált közeget alkalmaztak egy anioncserélő oszlopra (250 ml ágy térfogat), amelyet I pufferrel (25 mM Hepes, pH 7.0) egyenlítettek ki. Az oszlopot három oszloptérfogattal mostuk, mielőtt három oszlopvolumen I pufferrel eluáltuk, kiegészítve 1 M NaCl-lel. Az átfolyásos volt puffer-megváltozott a puffer II. (25 mM Tris-HCl, pH-ja 8.5) a 100 ml-es, illetve a kérelmemet, hogy egy anion-csere oszlop az idők folyamán egyensúlyba kerül a puffer II. Az oszlop volt mosni, két oszlop mennyiségű puffer II. eluálódnak a két oszlop mennyisége 0,1–0,5 M lineáris NaCl gradiens., Egyenként 10 ml-es frakciókat gyűjtöttek össze,és az alikvótákat a transwell assay 1640 RPMI-vel cserélték. Aktív frakciók összevonták, majd puffer-megváltozott a 10 ml a puffer, II., illetve rakják a heparin oszlop (5 ml ágy kötet) az idők folyamán egyensúlyba kerül a puffer II. Az oszlop volt mosni 12 oszlop mennyiségű puffer II. eluálódnak 4 oszlop mennyiségű 0-2 M lineáris NaCl gradiens. Az egyes 2 ml-es frakciókat összegyűjtöttük, és az alikvótákat pufferbe cseréltük az rpmi 1640-rel a transwell-vizsgálathoz. Az aktív frakciókat ismét összevonták, a puffert 0-ra változtatták.,5 ml I puffer és egy Superdex-75 oszlopra (24 ml-es ágytérfogat) I. pufferrel kiegyenlítve.az oszlopot ezután egy oszlopos I. puffermennyiséggel eluálták. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtöttek össze, az aliquotokat pedig pufferrel cserélték az rpmi 1640-rel a transwell-vizsgálathoz. Aktív frakciók összevonták, koncentrált a 0.5 ml teher Mono S oszlop (1 ml ágy kötet) az idők folyamán egyensúlyba kerül a puffer I. oszlop volt mosni 12 oszlop mennyiségű puffer én pedig eluálódnak 25 oszlop mennyiségű 0-0.5 M lineáris NaCl gradiens., Az 1 ml-es frakciókat összegyűjtötték, az aliquotokat pedig pufferrel cserélték az rpmi 1640-rel a transwell-vizsgálathoz. Aktív frakciók összevonták, puffer-változott a koncentrált be 50 µl pufferrel, de újratöltve rá a Mono-S oszlop az idők folyamán egyensúlyba kerül a puffer I. oszlop volt mosva a három oszlop mennyiségű puffer én is tartalmazó 0,3 M NaCl, valamint eluálódnak a 24 oszlop volumene 0,3–0,4 M lineáris NaCl gradiens., Az egyes 1 ml-es frakciókat összegyűjtöttük, és az alikvotokat az rpmi 1640-gyel módosítottuk a végső transzwell-vizsgálathoz, hogy azonosítsuk azt a frakciót, amely a legerősebb kemoatraktáns aktivitást tartalmazta.
Tömegspektrometriai elemzés
Az utolsó tisztítási lépés frakcióit 50 µl-re koncentráltuk, és 12% – os NuPAGE géleken (Invitrogén) elemeztük. A géleket a Pierce silver folttal festették a tömegspektrometriához (Thermo Fisher Scientific) A gyártó protokollja szerint., A legerősebb kemoattraktáns aktivitást tartalmazó frakcióban a megnövekedett intenzitású sávokat kivágták, és gélen belüli emésztésnek vetették alá, mielőtt Q Exactive HF tömegspektrométerrel (Thermo Fisher Scientific) elemezték őket. A tömegspektrometriai adatokat a SWISSPROT adatbázis segítségével elemeztük a MASCOT keresőmotorral.
A címkézett rekombináns CCL21, kötelező érvényű assay
Az egér CCL21 kódoló szekvenciát volt erősített a C57BL/6 egér lép cdns, valamint klónozott között a NdeI, valamint XhoI oldalak a pET22b+ expressziós vektor (Novagen), amely egy C-terminális A tag., A rekombináns fehérjét BL21 (DE3) egerekben fejeztük ki, majd a címkéjével tisztítottuk. A fehérje tisztaságát és koncentrációját az SDS–PAGE, illetve a BCA vizsgálattal értékelték, a bioaktivitást pedig kalcium mobilizációs vizsgálattal igazolták. A rekombináns fehérjéket -80 °C-on tárolták a felhasználásig. A ccl21 mérése-a gpr174-hez való kötődése, a ccr7 pozitív kontrollként 293t cellákat transzfektáltak GPR174-GFP vagy CCR7–GFP fúziós konstrukciókkal., A transzfektált sejtek aliquotjait ezután ccl21–vel inkubáltuk-a fehérjét 30 percen át 37 °C-on jelzett koncentrációban, kétszer hideg PBS-vel mossuk, majd azonnal 4% paraformaldehiddel rögzítjük. A PBS-ben végzett mosás után a rögzített sejteket phycoerythrin-konjugált Anti-his antitesttel (j095g46 klón, Biolegend) festették, és áramlási citometriával elemezték., Az egyes mintákban a GFP− sejtek nem specifikus háttérfestésként szolgáltak belső kontrollként, és a phycoerythrin konjugált Anti-his antitesttel festett GFP+ sejtek átlagos fluoreszcencia intenzitását (MPI), a megfelelő GFP-sejtek kivonásával, a specifikus CCL21 kötés számszerűsítésére használták.
A kemokin által kiváltott kalcium fluxusok mérése
egér Gpr174 és Ccr7-et PCR-vel erősítették, és a pRK5 plazmidba klónozták. A HEK293T sejteket átmenetileg gpr174-expresszáló, CCR7-expresszáló vagy kontroll plazmiddal transzfektálták., A sejteket a transzfekciót követően fizikailag leválasztották a 48 órás tenyészedényről, kétszer PBS-vel mosták, és 1 µM Indo-1 (Invitrogén) PBS-ben festették 37 °C-on 30 percig. Miután kétszer PBS-szel mosták, a sejteket Hanks kiegyensúlyozott sóoldatával (Invitrogen) reszuszpendálták, amely 25 mM Hep-t és 1% FBS-t tartalmaz, és jégen tartották. Kemokin stimulációnak vetve a sejteket először 37 °C-os vízkötegbe vitték 5 perc inkubálás után, majd egy LSR II citométeren (BD Biosciences) értékelték, hogy megállapítsák a nem stimulált állapot alapvonalát., A sejteket 0, 1 ng ml−1 és 10 µg ml−1 közötti rekombináns ccl21 koncentrációs sorozattal stimulálták. Az egyes állapotokban lévő sejteket folyamatosan monitorozták és 2 percig rögzítették. Végül 1 µg ml−1 végső koncentrációban ionomicint (Sigma) adtak a mintához, majd a mintát tovább monitorozták és 1 percig rögzítették. Az Indo-1 (kötött) / Indo-1(szabad) arányokat használták az intracelluláris Ca2+ koncentrációk jelzésére, a FlowJo (TreeStar) elemzése szerint. Az ionomicin által stimulált legmagasabb Ca2+ koncentrációt 100% – ban használták a ccl21 által kiváltott kalciumválasz normalizálására., Az EC50-et GraphPad-ban becsülték meg egy három paraméteres, nemlineáris dózis-válasz görbe illesztésével.
Immunoprecipitation, valamint western blot
Frissen izolált egér B-sejtek a GPR174–GFP BAC transzgenikus egerek aktiválni 10 µg ml−1 F(ab’)2 kecske anti-egér IgM, illetve 10 µg ml−1 anti-CD40 48 h. Ezek az aktivált B-sejtek, majd felfüggesztették a 2 × 107 sejt / milliliter a RPMI tartalmazó adathordozó 1% FBS, illetve nem kezelik, vagy stimulált 300 ng ml−1 CCL21 37 °C-on 30 perc. A B-sejteket ezután azonnal lizálták 1% NP – 40 lízis pufferben (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glicerin és proteáz inhibitorok). A GFP-tagged GPR174 immunprecipitációjához 108 B-sejt lizátumát inkubáltuk egy éjszakán át 20 µl GFP-Trap gyöngyökkel (ChromoTek). Ismételt mosás után az immunoprecipitátokat 0,2 M glicin pufferben (pH 3,0) szobahőmérsékleten 10 percig inkubáljuk, majd 1 m Tris-HCl-vel (pH 8,5) semlegesítjük. A fehérjéket SDS-PAGE választotta el egymástól, és átkerült a polivinilidén membránra (Millipore). A membránokat 5% BSA-t és 0,1% Tween 20-at tartalmazó Tris-pufferolt sóoldattal blokkolták., A célmolekulák immunoblottálással történő kimutatására nyúl anti-GFP (Abcam), nyúl anti-Gai-1 (Abcam), nyúl anti-gai-2 (Abcam) és nyúl anti-Ga13 (Abcam) antitesteket használtunk. A HRP-konjugált kecske anti-nyúl antitestet a Bioeasytech-től vásárolták. Az immunoblotokat fokozott kemilumineszcenciával (Thermo Fisher Scientific) detektálták, a képeket pedig ImageJ szoftverrel elemezték.
kvantitatív PCR
a kívánt típusú sejteket FACSAria III-mal válogattuk, és az rneasy Plus Mini vagy Micro kit (QIAGEN) segítségével teljes RNS extrakciónak vetettük alá a gyártó utasításai szerint., Az RNS-t az All-In-One RT MasterMix (Abm) reverz transzkripálta. A kvantitatív PCR-t qPCR MasterMix (Abm) segítségével hajtottuk végre egy 7500 valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., A célgének relatív expresszióját a különböző minták között összehasonlítottuk a normalizáció után az Actb vagy a Gapdh háztartási gének expressziójával szemben.
statisztikai Adatelemzés
statisztika és grafizálás Prism-ben (Graphpad) történt. Hacsak másként nem jelezzük, a Kétfarkú páratlan hallgatói t-teszteket a különböző csoportok végpont-eszközeinek összehasonlítására használták.
jelentési összefoglaló
a kutatástervezéssel kapcsolatos további információk a jelen tanulmányhoz kapcsolódó Nature Research Reporting összefoglalóban találhatók.