mi a Sanger szekvenálás?
Sanger szekvenálást, más néven “láncvégződési módszert”, Frederick Sanger angol biokémikus és kollégái fejlesztették ki 1977-ben. Ez a módszer a nukleotidbázisok szekvenciájának meghatározására szolgál egy DNS-darabban (általában kevesebb, mint 1000 bp hosszúságú). Sanger szekvenálása a 99.,99% bázis pontosság tekinthető a “gold standard” az érvényesítése DNS-szekvenciák, beleértve azokat is, már szekvenált keresztül újgenerációs szekvenálás (NGS). Sanger szekvenálást alkalmaztak az emberi Genomprojektben az emberi DNS viszonylag kis töredékeinek szekvenciáinak meghatározására (900 bp vagy annál kevesebb). Ezeket a fragmentumokat nagyobb DNS-fragmensek és végül teljes kromoszómák összeállítására használták.
Sanger szekvenálás VS NGS
az NGS technológiák fejlesztése felgyorsította a genomikai kutatásokat. Az NGS egyidejűleg több mint 100 gént és teljes genomokat szekvenciálhat alacsony bemenetű DNS-sel., A Sanger szekvenálást továbbra is széles körben használják a szekvenálás területén, mivel számos kiemelkedő előnyt kínál: (i) költséghatékonyság Az egyes gének szekvenálásához és (ii) 99,99%-os pontosság, különösen alkalmas helyszíni mutagenézis vagy klónozott betétek hitelesítési szekvenálására.
hogyan működik a Sanger szekvenálás?
Sanger-szekvenálásban a DNS-szintézis kiindulópontjaként a sablon DNS-t kiegészítő DNS-alapozót (a szekvenálandó DNS-t) használják., A négy dezoxinukleotid-trifoszfát (dNTPs: a, G, C és T) jelenlétében a polimeráz kiterjeszti az alapozót a kiegészítő dNTP hozzáadásával a sablon DNS szálához. Annak meghatározásához, hogy melyik nukleotid van beépítve a nukleotidok láncába, négy, különálló fluoreszkáló festékkel jelölt didoxinukleotid-trifoszfátot (ddntps: ddATP, ddGTP, ddCTP és ddTTP) használnak a szintézis reakció megszüntetésére. A dNTPs-hez képest a ddntps-nek van egy oxigénatom, amelyet eltávolítottak a ribonukleotidból, ezért nem képezhet kapcsolatot a következő nukleotiddal., A szintézist követően a reakciótermékeket a különböző láncvégződésű nukleotidtól függően egyetlen gél négy sávjába töltik be, és gélelektroforézisnek vetik alá. Méretük szerint így meghatározzák a DNS szekvenciáját.
1.ábra. A szerkezet a ddNTP és dNTP.
Image credit:” Whole-genome sequencing: ábra 1, ” By OpenStax College, Biology).,
Sanger szekvenálási lépések
a Sanger szekvenálási módszer 6 lépésből áll:
(1) A kettős szálú DNS (dsDNA) denaturálódik két egyszálú DNS-be (ssDNA).
(2) a szekvencia egyik végének megfelelő alapozó van rögzítve.
(3) Négy polimeráz oldat, négyféle dntp-vel, de csak egy típusú ddNTP kerül hozzáadásra.
(4) A DNS-szintézis reakciót indítja, és a lánc addig húzódik, amíg a vég nukleotid véletlenszerűen be nem épül.
(5) a kapott DNS-fragmentumokat ssDNA-ba denaturálják.,
(6) a denaturált fragmentumokat gélelektroforézissel választjuk el, és meghatározzuk a szekvenciát.
2.ábra. A Sanger szekvenálási módszer 6 lépésben (adaptált Gauthier 2008).