CRISPR/Cas9 által közvetített genom szerkesztés indukálja exonban kihagyom alternatív splicing vagy exonban törlés

nemrég használt CRISPR, hogy megzavarják a Kras onkogén, a két független tüdő adenocarcinoma sejtvonal , amely származnak Kras G12D; p53 fl/fl (KP) egerek . Elkülönítettünk két egysejtű klónt, amelyek mindegyike frameshifting törléseket hordoz az exon 2-ben(ábra., 1a és további 1. fájl: S1A ábra): a KP1 2-nt “-CG” törlést hordoz a G12D allélban és 1-nt “-C” törlést az egyébként vad típusú (WT) Kras allélban; a KP2 pedig 2-nt “-GG” törlést hordoz. Egyik klón sem termel teljes hosszúságú Kras fehérjét, jelezve, hogy mindhárom törlés megzavarja a Kras olvasási keretet.

az Olvasási mutációk korai exons ismert kiváltó nonszensz-mediált bomlás (NMD) , amely megszünteti mRNAs a korai megszűnése kodon alapján. Az mRNS-szekvenálás (RNS-seq) adatainak elemzésekor azonban azt találtuk, hogy a látszólagos Kras mRNS szintek (azaz a teljes normalizált mRNS olvasás) csak a KP1 sejtekben 19% – kal, a KP2 sejtekben pedig 47% – kal csökkentek a szülői KP sejtekhez képest (ábra. 1b). Mindkét klón kevesebb exon 2 olvasatot produkált, de az exon 1 és 3 normál szintje (ábra., 1C), ami arra utal, hogy az exon 2 kimaradhat a KP1 és KP2 klónokban. Valóban, észleltük exon 1-3 junction olvasás, jelezve, hogy exon 2 kimarad (ábra. 1c és további 1. fájl: S1B ábra). Az exon 2 olvasása és a teljes olvasása közötti arány kiszámítása során megállapítottuk, hogy az exon 2 csak a KP1-klón Kras-jának 64,0 ± 9,1% – ában szerepel (ábra). 1c és 1. táblázat). Hasonló exon 2 ugrást figyeltek meg a KP2-klónokban (további 1.fájl: S1C ábra)., Concordantly, reverz transzkripció a Kras mrns követi polimeráz láncreakció (RT-PCR) hozott két termék: az egyik megfelelt ép Kras komplementer DNS (cdns), a másik pedig megfelelt a exonban 1-3 izoforma (Fig. 1d). Az exon 1-3 izoform megtartja a részleges Kras nyílt olvasási keret, amely kezdeményezheti fordítás ATG kodon exon 3 (További fájl 1: ábra S2), és készítsen egy súlyosan csonka Kras fehérje.,

a Kras szerkesztése nem váltott ki alternatív splicing Genom-széles. 97 exont azonosítottunk a KP1 cellákban és 177 eseményt a KP2 cellákban. KP1 és KP2 klónok megosztott 22 kazettás felvétel vagy kizárás események, kizárásával Kras exon 2 hogy a legnagyobb változás mindkét klónok (ábra. 1e és további 1. fájl: S3 táblázat). Így, szerkesztése Kras exon 2 kifejezetten indukált kihagyása Kras exon 2., Különösen, mivel egér Kras G12D (GGU, hogy GAU) átiratok ne hagyja ki exonban 2 a szülői KP sejtek, azt találtuk, hogy a ~15% – a emberi KRAS G12S (kodon 12 GGU, hogy AGU) másolatok kihagyása exonban 2 a A549 emberi tüdőrák sejtvonal (Előfordulhat, hogy a fájl 1: Ábra S1d). Nem tudtuk, hogy megjósolni, hogy a nyereség vagy veszteség a exonban splice fokozó vagy hangtompítók , de az adatok arra utalnak, hogy a szekvenciák közelében Található kodon 12 támogassák exonban 2 felvétel egér emberi Kras. A CRISPR-szerkesztés által kiváltott Exon-kihagyás nem korlátozódott a Kras-ra vagy az egér KP-sejtekre., Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a FLOT1 exon 3 hela sejtekben történő CRISPR-szerkesztése az exon 3, exon 4 vagy exons 3, 4 és 5 kihagyását okozhatja . Azt is észleltük, ritka exon kihagyás, amikor célzott exon 11 LMNA humán HCT116 sejtek (további fájl 1: ábra S3). Az LMNA exon 11 kihagyása olyan képkocka-átiratot eredményez, amelyet neomorf fehérjévé lehet fordítani.

további fedezze fel az ötlet, hogy exonban kihagyom lehet előállítani egy funkcionális in-frame átirat, azt kérdeztük, hogy CRISPR által közvetített szerkesztés Ctnnb1 exonban 3 meggyőzhetnék exonban kihagyom, ami egy gain-of-function fenotípus., Exonban 3 Ctnnb1 kódolja phosphoacceptor maradványok, amelyek elősegítik a bomlás a β-Catenin transzkripciós faktor ; genetikai kimetszés, a Ctnnb1 exonban 3—amely a keret exonban 4—stabilizálja a folyamatosan aktív β-Catenin, hogy felhalmozódik a mag . Terveztünk 11 sgRNAs, hogy a cél régiók mentén Ctnnb1 exon 3 (Ctnb1-sg1 – sg11), átalakított egyes sgRNAs a KP sejtek, és használt nagy áteresztőképességű szekvenálás mértékének elemzésére szerkesztés Az sgRNA cél helyén minden sorban (ábra. 2b X-tengely, 1. kiegészítő fájl: S4 Ábra és 2. Kiegészítő fájl: S4 táblázat)., Három sgRNAs (sg6, sg9 és sg10) nem hatékonyan célzott Ctnnb1. A Ctnnb1 sgRNAs-ok közül nyolc (sg1-sg5, sg7, sg8 és sg11) azonban Indel-eket indukált célterületükön, amelyek frekvenciája meghaladta a 20% – ot. Például a Ctnnb1-sg1 + t beillesztéseket generált az olvasás körülbelül 65% – ában (ábra. 2c). Az erős ctnnb1 sgRNA által megcélzott minden populációban három RT-PCR terméket észleltünk, amelyek 2-5 exonokat ölelnek fel (ábra. 2d). A fő termék megfelel az általában összekapcsolt átiratnak, amely magában foglalja az exon 3-at. A másik két termék megfelel az alternatív spliced átiratoknak: az egyik, amely kihagyja az exon 3-at (azaz, exon 2-4 splicing, ábra. 2e) és az egyik, hogy kihagyja mind exons 3 és 4 (azaz, exon 2-5 splicing, ábra. 2f). A CTNNB1 sgRNAs egyik DNS-szál indukálta exon-ugrást célozta meg, a Cas9 nukleázaktivitás pedig elengedhetetlen volt az exon-ugráshoz (2.ábra). 3a).

Western blot analysis kimutatta, hogy az erős sgrnákkal transzdukált sejtpopulációk kisebb ~74 kD β-Catenin fehérjét termelnek, amely megfelel az exon 2-4 splice terméktől elvárt méretnek (ábra. 2g). A teljes hosszúságú β-Katenin fehérje nem volt szignifikánsan kimerült négy nappal a transzdukció után. Annak tesztelésére, hogy az alternatív splicing függ-e a Cas9 vagy az sgRNA folyamatos expressziójától a lentivirális vektorokban, a Cas9 és a Ctnnb1-sg1 vagy a nem célzott sgRNA kontrollt társítjuk., Hét nappal a transzfekció után, amikor a Cas9 és a guide RNS kimerül, megvizsgáltuk a β-Katenin lokalizációját immunfluoreszcenciával. Egér fibroblaszt sejtek transzfektált egy nem célzott kontroll sgrna, β-Catenin lokalizált sejt csomópontok (további fájl 1: ábra S5a). Ezzel szemben sok ctnnb1-sg1-vel transzfektált sejtben β-Katenint észleltünk a magban (további fájl 1: S5A ábra)., Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az exon átugrásához nincs szükség folyamatos szerkesztésre, és hogy a Ctnnb1 exon 3 CRISPR-mediált szerkesztésével kiváltott exon 3 átugrás a β-Catenin izoform gain-of-function-ot eredményez.

tovább elemeztük a ctnnb1-sg2, -sg3 és-sg5-tel kezelt sejtpopulációkban a 2-7. exonok átiratait. Amellett, hogy a teljes hosszúságú izoforma, észleltünk négy ezeket exonban 2 úgy tűnik, használjunk, hogy minden downstream exonban (azaz exonban 2-4, exonban 2-5, exonban 2-6, valamint exonban 2-7; Fig. 3a, b)., Nem értjük, hogy ez a mechanizmus úgy tűnik, kicsapongó exonban kihagyom által kiváltott Ctnnb1 exonban 3 szerkesztése, sem voltunk képesek, hogy összehasonlítsa kicsapongó exonban kihagyom speciális célterület, vagy indel mutációk exonban 3. Mindazonáltal izoláltunk egy ctnnb1-sg3 szerkesztett klónt, amely potenciális mechanizmust javasol (további fájl 1: S6A ábra). Ez a biallelikus klón 3-bp in-frame törlést tartalmaz az egyik allélon, a másikon pedig egy nagy 832-bp törlést; a 832-bp törlés az 5 “intron 2 végét az exon 3” végére 4 (További fájl 1: S6 ábra)., Két átiratot észleltünk ezekben a cellákban: a megfelelően illesztett átiratot, amely tartalmazza a 3-bp törlést, valamint egy átiratot, amely magában foglalja az intron 2-t, amely az exon 4-hez olvadt (további 1. fájl: S6c Ábra és 1. táblázat). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szerkesztett sejtek populációiban észlelt látszólagos exon-ugrások tükrözhetik az exonokat eltávolító Genom átrendeződéseket.

két kísérlet alátámasztja azt az elképzelést, hogy egyetlen sgRNA nagy genomikus deléciókat indukálhat, amelyek eltávolítják az exonokat., Például izoláltunk 15 klónt az egér 3T3 sejtjeiből, amelyeket Cas9 és Ctnnb1-sg1 transzmisszióval átvittünk, és azt találtuk, hogy négy klón (azaz 4, 5, 13 és 15 klónok) látható exontrollt mutatott az RT-PCR által. Genomikus PCR kiderült genom rearrangements három ezek a klónok: nagy törléseket (>500 bp), valamint a kisebb törléseket (~100 bp) a klónok 4, 15, nagy megtalálását klónok 13, illetve 15 (Előfordulhat, hogy a fájl 1: Ábra S7)., Sőt, miután célzás exonban 6 p65/Kapcsolat elszigetelt egy biallelic p65 klón (#15): az egyik allél kikötők 1-nt “+A” beillesztés, a másik kikötők egy 2268-bp törlés hogy eltávolítja exons 5, 6, 7 (Előfordulhat, hogy a fájl 1: Ábra S8a, c–e). A P65 #15 klón esetében a teljesen illesztett átiratot és egy exon 4-8 splice terméket észleltük (további 1.fájl: S8C ábra). Mind az allélek kódolják a frameshifted átiratokat, mind a P65 átiratokat alacsonyabb szinteken, mint a WT (további fájl 1: S8B ábra)., Elkülönítettünk egy szerkesztett P65 klónt (#31) homozigóta ugyanarra a + A beillesztésre, mint a #15 klónban, de a #31 klón nem készít alternatív spliced átiratokat. Így az exon 4-8 spliced átirata a # 15 klónban az exons 5, 6 és 7 törléséből származik. Ezek a nagy exon törlési események váratlanok voltak, és tipikus PCR-alapú szűrővizsgálatok segítségével hiányoztak.,

az a képesség, hogy a gain-of-funkció tevékenység indukálásával exon ugró vagy exon kimetszés azt javasolta, hogy CRISPR-meditated szerkesztési egyetlen sgRNA lehet hasznos módja annak, hogy részben mentési funkció egy betegség gén, amely megköveteli az alacsony szintű mentési. CRISPR által közvetített homológ DNS-javítás, használt megfelelő korai stop kodon mutációk a Dmd gén egér modellben a DMD több csoportok használt CRISPR törölni a Dmd exons, részben visszaállítani a Dmd kifejezés . Négy Sgrna/Cas9 lentivírust terveztünk, amelyek a Dmd gén exon 23 különböző helyszíneit célozzák meg (ábra., 4A, b) és transzducált egér c2c12 myoblastok, egy sejtvonal, amelyet széles körben használnak a Duchenne izomdisztrófia (DMD) modelljeként . A Dmd Sgrnas-szal átalakított C2c12 sejtekben olyan RT-PCR terméket találtunk, amely megfelel az exon 23-at tartalmazó normál splice terméknek. Szekvenálás ezek az RT-PCR-termékek kiderült, hogy csak a Dmd-sg2 hatékonyan szerkesztett Dmd exonban 23, amint azt kevert sorrend csúcsok túl a sgRNA célterületre (Előfordulhat, hogy a fájl 1. Ábra: S9). A Dmd-sg2-vel átalakított sejtekben egy RT-PCR terméket is észleltünk, amely megfelel az exon 22-nek, amely az exon 24-hez van kötve (ábra. 4c, d)., Így az exon 23 egy sgRNA-val történő célzása elegendő lehet a részleges exon kihagyás kiváltásához és egy ép dystrophin nyílt olvasási keret létrehozásához. A DMD egy klasszikus példa egy olyan betegségre, amelyben kis mennyiségű funkcionális helyreállítás jelentős klinikai előnyökkel járhat .