Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., I topi con deficit di GPR174 sono stati generati da procedure standard di targeting genetico per sostituire il frame di lettura aperto Gpr174 con una cassetta LacZ / neo utilizzando la linea di cellule staminali embrionali 129SvEvBrd (Texas A&M Institute for Genomic Medicine, TG0128). Questi topi GPR174-carenti sono stati backcrossed ai topi C57BL/6 per 12 generazioni. Topi rilevanti sullo sfondo C57BL/6 sono stati incrociati per ottenere topi MD4 che esprimono GFP e topi MD4 che esprimono dsRed GPR174-sufficienti o carenti., Per gli esperimenti sono stati utilizzati littermates di età compresa tra 6 e 12 settimane di età e dei sessi indicati. Le dimensioni del campione per gli esperimenti sui topi sono state determinate empiricamente e i topi sono stati assegnati in modo casuale al gruppo di controllo o sperimentale. Nessun accecamento era necessario per gli esperimenti sui topi presentati qui. Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni specifiche senza patogeni e sono stati utilizzati in conformità con le linee guida governative e Tsinghua Institutional Animal Care and Use Committee per il benessere degli animali.,
Topi transgenici GPR174–GFP BAC
Le sequenze che codificano per il linker glicina–glicina–glicina–serina (GGGS) (ripetuto quattro volte) e GFP migliorato (EGFP) sono state inserite immediatamente prima del codone di arresto del frame di lettura aperto GPR174 nel clone del mouse BAC RP23-206J14 mediante ricombinazione omologa. Il BAC modificato è stato purificato e microiniettato nel pronuclei degli ovuli fecondati per generare reporter transgenici. Un topo fondatore che è stato sottoposto a screening positivo per le cellule B che esprimono GFP nel sangue è stato utilizzato per allevare ulteriormente con topi B6 per stabilire il ceppo BAC GPR174–GFP.,
Coltura cellulare, retrovirus e trasduzione in vitro
Le cellule T naive o le cellule B sono state isolate utilizzando il kit di isolamento delle cellule T CD4 negativo o il kit di isolamento delle cellule B naive (Miltenyi Biotec) secondo i protocolli del produttore. Per sovraesprimere i geni bersaglio nelle cellule B, le cellule B purificate sono state attivate con 1 µg ml−1 lipopolisaccaride (Sigma) per 1 giorno prima di essere spin-infettate con supernatanti retrovirali a 1.500 g per 2 h, come descritto18.
Costruzione di chimere del midollo osseo
I topi riceventi B6 sono stati irradiati letalmente dai raggi X (5.,5 Gy, due volte) e poi somministrato un trasferimento endovenoso di 3 × 106 cellule del midollo osseo accoppiate tra loro, costituite da cellule µMT all ‘ 80% e cellule GPR174-sufficienti o carenti al 20%. Le chimere sono state utilizzate per esperimenti da sei a otto settimane dopo la ricostituzione.
Gonadectomia
I topi dopo lo svezzamento sono stati anestetizzati con avertin (2,5%, 0,015 ml g−1 peso corporeo) per via intraperitoneale. Per l’ovariectomia di topi femmine, le ovaie su entrambi i lati sono state esposte e rimosse attraverso incisioni dorsali bilaterali., Per l’orchidectomia nei topi maschi, è stata eseguita un’incisione addominale mediana per esporre e rimuovere i testicoli su entrambi i lati. I topi di controllo Sham-operati sono stati sottoposti a interventi chirurgici comprendenti incisioni dorsali bilaterali o un’incisione addominale mediana senza rimozione di ovaie o testicoli. Le aperture della ferita chirurgica sono state suturate e gli antibiotici e gli analgesici sono stati applicati localmente. I topi sono stati autorizzati a recuperare per otto settimane prima degli esperimenti successivi.,
Trattamento con testosterone
Topi da sei a otto settimane sono stati iniettati per via sottocutanea con testosterone (10 mg kg – 1 di peso corporeo) disciolto in olio di semi di girasole a giorni alterni per due settimane. I topi di controllo del veicolo sono stati trattati con olio di semi di girasole da solo.
Trasferimento adottivo, immunizzazione e infezione virale
Per misurare la formazione del centro germinale da parte delle cellule B MD4, 105 cellule T OT-II e 5 × 105 cellule B MD4 dei genotipi indicati sono state trasferite per via endovenosa in riceventi B6 maschi, che sono stati successivamente immunizzati per via sottocutanea con 0.,5 µg di lipopolisaccaride e 30 µg di antigene coniugato HEL–OVA in allume (termo scientifico). L’HEL-OVA è stato realizzato mediante reticolazione chimica con un kit di coniugazione HydraLink (SoluLink) come descritto in precedenza19. Per misurare la formazione del centro germinale in risposta all’immunizzazione SRBC o all’infezione da virus della coriomeningite linfocitica (LCMV), i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 5 × 108 SRBCs (da Z. Baiji) o 2 × 105 unità di formazione della placca del virus Armstrong LCMV (da L. Ye e R. Ahmed).,
EAE by MOG protein immunization
La sequenza che codifica i primi 120 amminoacidi del MOG umano è stata amplificata dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) da una libreria di DNA complementare del cervello umano e clonata tra i siti NdeI e XhoI del vettore di espressione pET22b+ (Novagen). La proteina MOG umana è stata espressa in BL21(DE3) Escherichia coli e purificata dal suo tag di istidina carbossi-terminale (His). La purezza e la concentrazione delle proteine sono state valutate rispettivamente con il test della proteina SDS–PAGE e dell’acido bicinchoninico (BCA). Le proteine ricombinanti sono state conservate a -80 °C fino all’uso., Per indurre EAE, gli animali midollo-chimerici dei tipi indicati sono stati immunizzati per via sottocutanea sul fianco con 200 µg di proteina MOG umana ricombinante emulsionata in adiuvante di Freund completo il giorno 0. I topi sono stati iniettati per via endovenosa con 200 ng di tossina della pertosse (Invitrogen) nei giorni 0 e 2. I topi sono stati monitorati giornalmente in modo cieco per la progressione della malattia dal giorno 1. La gravità della malattia è stata valutata come segue: 0, nessun segno clinico; 1, coda paralizzata; 2, perdita di movimento coordinato e paresi degli arti posteriori; 2.5, paralisi di un arto posteriore; 3, paralisi di entrambi gli arti posteriori; 3.,5, paralisi di entrambi gli arti posteriori e debolezza negli arti anteriori; 4, paralisi degli arti anteriori; e 5, moribondo. Per confrontare la gravità della malattia, abbiamo studiato dieci topi per condizione per esperimento e analizzato i punteggi della malattia nel tempo con ANOVA bidirezionale.
Citometria a flusso
Misurazione dei titoli anticorpali antigene-specifici
Per misurare i titoli anticorpali SRBC-specifici, abbiamo lisato 5 × 108 SRBC con 1 ml di acqua doppia distillata e li abbiamo centrifugati a 15.000 giri al minuto per 20 min., Il pellet è stato risospeso in PBS e utilizzato per rivestire MaxiSorp enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) piastre (Nunc Maxisorp) durante la notte a 4 °C. Per misurare gli anticorpi sierici specifici MOG, abbiamo usato 2 µg ml-1 MOG umano ricombinante purificato per rivestire le piastre ELISA. Il legame non specifico è stato bloccato con 1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS con Tween-20 (PBST) per 2 h a 37 °C, seguita da incubazione con 2× diluizioni seriche di campioni di siero di topi immunizzati per 1 h a 37 °C., Le piastre sono state lavate e incubate con anticorpo secondario anti-topo IgG coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (1/20.000) per 1 h a 37 °C. Le piastre sono state lavate,sviluppate con 3,3′, 5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) e fermate con 1 M HCl. Impostiamo i pozzetti vuoti come zero e registriamo l’assorbanza a 450 nm. Abbiamo usato sieri da topi non immunizzati come controllo negativo; il valore di cut-off era la densità ottica a 450 nm (OD450) del controllo negativo moltiplicato per 2.1. Un pozzo con un valore OD450 non inferiore al valore di cut-off è stato considerato positivo., La più alta diluizione di un campione che ha dato positività è il titolo del campione.
Distribuzione delle cellule B mediante immunoistochimica
Per vari esperimenti, le cellule B naive, le cellule B attivate per 1 h con 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (Jackson Immunoresearch) o le cellule B trasdotte con retrovirus sono state trasferite in riceventi B6. Quando necessario, queste cellule sono state etichettate con 1 µM tetrametilrodamina (TAMRA), 4-clorometil-6,8-difluoro-7-idrossicumarina (CMF2HC) o 5-clorometilfluoresceina diacetato (CMFDA) (Invitrogen)., Spleens o linfonodi inguinali dei topi riceventi sono stati fissati con 1% paraformaldeide per 12 h e poi disidratati in soluzione di saccarosio 30% per 12 h a 4 °C. Per garantire la massima rappresentazione di diverse regioni di organi nel set di dati finale, abbiamo elaborato sezioni di tessuto non consecutive e le abbiamo colorate con anticorpi indicati. I reagenti di colorazione includevano eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), coniglio anti-GFP (abcam) e AF488 capra anti-coniglio IgG (Invitrogen)., I vetrini sono stati montati con il reagente antifade ProlongGold (Invitrogen) ed esaminati con un microscopio verticale Olympus FV1000. Le immagini sono state analizzate con Imaris (Bitplane) e ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
Preparazione dello stroma splenico
Gli Spleens di topi, ratti o maiali sono stati ripetutamente pressati e macinati contro una rete metallica per rilasciare globuli rossi e linfociti. I restanti elementi di tessuto stromale amorfo insospettabili sono stati accuratamente lavati con PBS prima di essere posti in terreno di coltura privo di siero B27 (Invitrogen) e incubati a 37 °C per 12 ore., Per i topi, gli elementi stromali di tre animali sono stati coltivati in un mezzo da 1 ml. Per i suini, gli elementi stromali di 1 milza sono stati coltivati in 80 ml. La coltura risultante è stata centrifugata a 10.000 rpm per 60 min per ottenere il mezzo condizionato, che è stato immediatamente utilizzato per esperimenti o congelato a -20 °C fino all’uso.
Test Transwell
Le cellule B attivate con 1 µg ml−1 lipopolisaccaride per 60 h sono state utilizzate per il dosaggio di diverse frazioni risultanti dal frazionamento biochimico., Le cellule B naive o le cellule B attivate con 10 µg ml−1 F(ab’)2 goat anti-mouse IgM (Jackson Immunoresearch) e 10 µg ml−1 anti-CD40 (clone FGK4.5, Bio X Cell) sono state utilizzate per testare la migrazione indotta da CCL21. Quando le cellule B di genotipi diversi sono stati confrontati, almeno tre topi donatori di ogni genotipo e trattamento sono stati utilizzati per isolare le cellule B in ogni esperimento, e littermates sono stati sempre utilizzati. Le cellule B sono state sospese a 106 cellule per millilitro e riposate in un mezzo RPMI contenente 1% di FBS a 37 °C per 1 ora., Successivamente un totale di 100 µl di sospensione cellulare è stato aggiunto alla camera superiore in un Transwell a pori da 5 µm (Corning Costar) e un totale di 150 µl di soluzioni contenenti attrattivi è stato aggiunto alla camera inferiore. Queste soluzioni includevano terreno di coltura condizionato con preparazione di stroma splenico di topo grezzo, terreno di coltura condizionato con preparazione di stroma splenico di maiale grezzo, frazioni di eluizione da cromatografia, terreno di coltura contenente CCL21 e CCL19 ricombinanti (Peprotech) o 18/0 LysoPS (Avanti Polar Lipids) di concentrazioni indicate., Per alcuni esperimenti, il mezzo condizionato da stroma murino è stato inizialmente integrato con una concentrazione finale di anticorpi neutralizzanti 5 µg ml-1 contro il sistema CCL21 o CCL19 del topo (R&D) o il controllo isotipo IgG di capra e incubato a 4 °C per 3 h prima di essere utilizzato per il test transwell. La dose anticorpale era almeno sufficiente per neutralizzare 100 ng ml−1 CCL21 o CCL19, come determinato in esperimenti preliminari. Le cellule sono state autorizzate a trasmigrare per 3 h a 37 °C in un incubatore., Le cellule che erano migrate verso i pozzetti inferiori sono state enumerate dalla citometria a flusso, con celle fluorescenti A20 di numeri noti aggiunte immediatamente prima della lettura come standard di conteggio interno. Ogni condizione è stata misurata in pozzetti triplicati se non diversamente indicato.
Frazionamento biochimico
La cromatografia è stata effettuata utilizzando un sistema di cromatografia liquida a proteine veloci ÄKTApurifer 10 (FPLC) (GE Healthcare) a 4 °C, ad eccezione dell’ultima fase, che è stata effettuata utilizzando un sistema ÄKTAmicro FPLC (GE Healthcare)., Un totale di 1.200 ml di terreno condizionato da stroma suino è stato applicato a una colonna di scambio anionico (250 ml di volume del letto) bilanciata con buffer I (25 mm Hepes, pH 7.0). La colonna è stata lavata con tre volumi di colonna prima di essere eluita con tre volumi di colonna di buffer I integrato con 1 M NaCl. Il flusso è stato modificato con buffer II (25 mM Tris-HCl, pH 8,5) in 100 ml e riapplicato su una colonna a scambio anionico bilanciata con buffer II. La colonna è stata lavata con due volumi di colonna di buffer II ed eluita con due volumi di colonna di un gradiente NaCl lineare di 0,1–0,5 M., Sono state raccolte frazioni di 10 ml ciascuna e le aliquote sono state sostituite con RPMI 1640 per il test transwell. Le frazioni attive sono state raggruppate e sostituite in 10 ml con buffer II e caricate su una colonna di eparina (5 ml di volume del letto) bilanciata con buffer II. La colonna è stata lavata con 12 volumi di colonna di buffer II ed eluita con 4 volumi di colonna di 0-2 M di gradiente NaCl lineare. Sono state raccolte frazioni di 2 ml ciascuna e le aliquote sono state sostituite con RPMI 1640 per il test transwell. Le frazioni attive sono state nuovamente raggruppate, il buffer è cambiato in 0.,5 ml di buffer I e caricati su una colonna Superdex-75 (volume del letto da 24 ml) bilanciata con buffer I. La colonna è stata quindi eluita con un volume di una colonna di buffer I. Sono state raccolte frazioni di 0,5 ml ciascuna e le aliquote sono state modificate con RPMI 1640 per il test transwell. Le frazioni attive sono state raggruppate e concentrate in 0,5 ml per caricare su una colonna Mono S (1 ml di volume del letto) bilanciata con buffer I. La colonna è stata lavata con 12 volumi di colonna di buffer I ed eluita con 25 volumi di colonna di 0-0, 5 M di gradiente NaCl lineare., Sono state raccolte frazioni di 1 ml ciascuna e le aliquote sono state modificate con RPMI 1640 per il test transwell. Le frazioni attive sono state raggruppate, modificate con buffer e concentrate in 50 µl con buffer I e ricaricate sulla colonna Mono S bilanciata con buffer I. La colonna è stata lavata con tre volumi di colonna di buffer I contenenti 0,3 M NaCl ed eluita con 24 volumi di colonna di 0,3–0,4 M di gradiente lineare NaCl., Sono state raccolte frazioni di 1 ml ciascuna e le aliquote sono state modificate con RPMI 1640 per il test transwell finale per identificare la frazione che conteneva la più forte attività chemoattrattante.
Analisi di spettrometria di massa
Le frazioni dell’ultima fase di purificazione sono state concentrate in 50 µl e analizzate su gel NuPAGE al 12% (Invitrogen). I gel sono stati macchiati con la macchia Pierce silver per spettrometria di massa (Thermo Fisher Scientific) secondo il protocollo del produttore., Bande di intensità aumentata nella frazione contenente la più forte attività chemioattrattante sono state asportate e sottoposte a digestione in gel prima di essere analizzate con uno spettrometro di massa Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). I dati di spettrometria di massa sono stati analizzati utilizzando il database Swissprot con il motore di ricerca MASCOT.
His-tagged ricombinante CCL21 e binding assay
La sequenza di codifica del mouse CCL21 è stata amplificata da C57BL / 6 mouse spleen cDNA e clonata tra i siti NdeI e XhoI del pET22b+ expression vector (Novagen), che fornisce un C-terminal His tag., La proteina ricombinante è stata espressa in topi BL21(DE3)e purificata dal suo tag. La purezza e la concentrazione delle proteine sono state valutate rispettivamente con il test SDS-PAGE e BCA e la bioattività è stata verificata utilizzando un test di mobilizzazione del calcio. Le proteine ricombinanti sono state conservate a -80 °C fino all’uso. Per misurare il legame CCL21–His con GPR174, con CCR7 come controllo positivo, le cellule 293T sono state trasfettate con costrutti di fusione GPR174–GFP o CCR7–GFP., Aliquote di cellule trasfettate sono state quindi incubate con proteina CCL21-His a concentrazioni indicate a 37 ° C per 30 min, lavate due volte con PBS freddo e fissate immediatamente con 4% di paraformaldeide. Dopo lavaggi in PBS, le cellule fisse sono state macchiate con un anticorpo anti-His coniugato con ficoeritrina (clone J095G46, Biolegend) e analizzate mediante citometria a flusso., Le cellule GFP in ciascun campione fungevano da controllo interno di colorazione di fondo non specifico e l’intensità media di fluorescenza (MFI) delle cellule GFP+ macchiate con anticorpo anti-His coniugato con ficoeritrina, con la MFI delle corrispondenti cellule GFP sottratte, è stata utilizzata per quantificare il legame specifico CCL21.
La misurazione dei flussi di calcio innescati dalla chemochina
Il topo Gpr174 e Ccr7 sono stati amplificati mediante PCR e clonati nel plasmide pRK5. Le cellule HEK293T sono state transitoriamente trasfettate con plasmidi che esprimono GPR174, che esprimono CCR7 o controllano., Le cellule sono state fisicamente staccate dal vaso di coltura 48 h dopo la trasfezione, lavate due volte con PBS e colorate con 1 µM Indo-1 (Invitrogen) in PBS a 37 °C per 30 min. Dopo essere stati lavati due volte con PBS, le cellule sono state risospese con soluzione salina bilanciata di Hanks (Invitrogen) contenente 25 mm di Hepes e 1% di FBS e tenute sul ghiaccio. Quando sottoposti a stimolazione chemochina, le cellule sono state prima portate in un lotto di acqua a 37 °C per 5 minuti di incubazione, e quindi valutate su un citometro LSR II (BD Biosciences) per stabilire la linea di base per lo stato non stimolato., Le cellule sono state stimolate con una serie di concentrazioni di CCL21 ricombinante comprese tra 0,1 ng ml-1 e 10 µg ml-1. Le cellule ad ogni condizione sono state continuamente monitorate e registrate per 2 min. Alla fine, la ionomicina (Sigma) è stata ulteriormente aggiunta al campione ad una concentrazione finale di 1 µg ml−1 e il campione è stato ulteriormente monitorato e registrato per 1 min. I rapporti indo-1(legato)/Indo-1(libero) sono stati utilizzati per indicare le concentrazioni intracellulari di Ca2+, come analizzato in FlowJo (TreeStar). La più alta concentrazione di Ca2+ stimolata dalla ionomicina è stata utilizzata come 100% per normalizzare la risposta di calcio indotta da CCL21., L’EC50 è stato stimato in GraphPad adattando una curva dose–risposta non lineare a tre parametri.
Immunoprecipitazione e western blotting
mouse Appena isolato le cellule B GPR174–GFP BAC topi transgenici sono stati attivati con 10 µg ml−1 F(ab’)2 di capra anti-topo IgM e 10 µg ml−1 anti-CD40 per 48 h. Queste cellule B attivate sono stati poi sospesi a 2 × 107 cellule per millilitro nel medium RPMI contenente 1% FBS, e lasciata non trattata o stimolato con 300 ng ml−1 CCL21 a 37 °C per 30 min. Le cellule B sono state quindi immediatamente lisate nel tampone di lisi 1% NP-40 (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mm NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glicerolo e inibitori della proteasi). Per l’immunoprecipitazione di GFP-etichettato GPR174, i lisati di 108 cellule B sono stati incubati durante la notte con 20 µl di perle GFP–trappola (ChromoTek). Dopo ripetuti lavaggi, gli immunoprecipitati sono stati eluiti mediante incubazione in tampone di glicina 0,2 M (pH 3,0) per 10 min a temperatura ambiente e quindi neutralizzati con 1 M Tris-HCl (pH 8,5). Le proteine sono state separate da SDS-PAGE e trasferite alla membrana di polivinilidene (millipore). Le membrane sono state bloccate con soluzione salina tamponata con Tris contenente il 5% di BSA e lo 0,1% di Tween 20., Per rilevare le molecole bersaglio immunoblotting, abbiamo usato coniglio anti-GFP (Abcam), coniglio anti-Gai-1 (Abcam), coniglio anti-Gai-2 (Abcam) e coniglio anti-Ga13 (Abcam) anticorpi. L’anticorpo anti-coniglio di capra coniugato HRP è stato acquistato da Bioeasytech. Immunoblots sono stati rilevati utilizzando chemiluminescenza avanzata (Thermo Fisher Scientific), e le immagini sono state analizzate con il software ImageJ.
PCR quantitativa
Le celle dei tipi desiderati sono state ordinate con un FACSAria III e sottoposte all’estrazione totale di RNA con il kit RNeasy Plus Mini o Micro (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore., L’RNA è stato trascritto in senso inverso con la MasterMix RT (Abm) All-In-One. La PCR quantitativa è stata eseguita con qPCR MasterMix (Abm) su un sistema di PCR in tempo reale 7500 (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., L’espressione relativa dei geni bersaglio tra diversi campioni è stata confrontata dopo la normalizzazione con l’espressione dei geni di pulizia Actb o Gapdh.
Analisi dei dati statistici
Statistiche e grafici sono stati condotti in Prism (Graphpad). Se non diversamente indicato, i test t dello studente non accoppiati a due code sono stati utilizzati per confrontare i mezzi di endpoint di diversi gruppi.
Reporting summary
Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.