Che cos’è il sequenziamento Sanger?
Il sequenziamento di Sanger, noto anche come “metodo di terminazione a catena”, è stato sviluppato dal biochimico inglese Frederick Sanger e dai suoi colleghi nel 1977. Questo metodo è progettato per determinare la sequenza di basi nucleotidiche in un pezzo di DNA (comunemente meno di 1.000 bp di lunghezza). Sanger sequenziamento con 99.,l’accuratezza di base del 99% è considerata il “gold standard” per la convalida delle sequenze di DNA, comprese quelle già sequenziate attraverso il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Sanger sequenziamento è stato utilizzato nel progetto Genoma umano per determinare le sequenze di relativamente piccoli frammenti di DNA umano (900 bp o meno). Questi frammenti sono stati utilizzati per assemblare frammenti di DNA più grandi e, infine, interi cromosomi.
Sanger Sequencing VS NGS
Lo sviluppo delle tecnologie NGS ha accelerato la ricerca genomica. NGS può sequenziare simultaneamente più di 100 geni e genomi interi con DNA a basso input., Il sequenziamento Sanger rimane ampiamente utilizzato nel campo del sequenziamento in quanto offre diversi vantaggi importanti: (i) efficienza dei costi per il sequenziamento di singoli geni e (ii) precisione del 99,99%, particolarmente adatta per il sequenziamento di verifica per mutagenesi diretta al sito o inserti clonati.
Come funziona il sequenziamento Sanger?
Nel sequenziamento Sanger, un primer DNA complementare al DNA modello (il DNA da sequenziare) viene utilizzato per essere un punto di partenza per la sintesi del DNA., In presenza dei quattro trifosfati deossinucleotidici (DNTP: A, G, C e T), la polimerasi estende il primer aggiungendo il dNTP complementare al filamento di DNA del modello. Per determinare quale nucleotide è incorporato nella catena di nucleotidi, quattro trifosfati dideossinucleotidi (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP) etichettati con un colorante fluorescente distinto vengono utilizzati per terminare la reazione di sintesi. Rispetto a dNTPs, ddNTPs ha un atomo di ossigeno rimosso dal ribonucleotide, quindi non può formare un collegamento con il nucleotide successivo., Dopo la sintesi, i prodotti di reazione vengono caricati in quattro corsie di un singolo gel a seconda del diverso nucleotide terminante a catena e sottoposti a elettroforesi su gel. In base alle loro dimensioni, viene quindi determinata la sequenza del DNA.
Figura 1. La struttura di ddNTP e dNTP.
Immagine di credito: “Intero-genoma sequenziamento: Figura 1,” da OpenStax College, Biologia).,
Passi di sequenziamento Sanger
Il metodo di sequenziamento Sanger consiste di 6 passi:
(1) Il DNA a doppio filamento (dsDNA) viene denaturato in due DNA a singolo filamento (ssDNA).
(2) È collegato un primer che corrisponde a un’estremità della sequenza.
(3) Vengono aggiunte quattro soluzioni di polimerasi con quattro tipi di DNTP ma solo un tipo di ddNTP.
(4) La reazione di sintesi del DNA inizia e la catena si estende fino a quando un nucleotide di terminazione è casualmente incorporato.
(5) I frammenti di DNA risultanti sono denaturati in ssDNA.,
(6) I frammenti denaturati sono separati mediante elettroforesi su gel e la sequenza è determinata.
Figura 2. Il metodo di sequenziamento Sanger in 6 passaggi (adattato da Gauthier 2008).