CRISPR/Cas9-mediata genome editing induce exon skipping da splicing alternativo o delezione esone

di recente, Abbiamo utilizzato CRISPR a disturbare l’oncogene Kras in due indipendenti linee di cellule di adenocarcinoma del polmone , che sono stati derivati da Kras G12D; p53 fl/fl (KP) topi . Abbiamo isolato due cloni a cella singola che trasportano eliminazioni di frameshifting nell’esone 2 (Fig., 1a e file aggiuntivo 1: Figura S1a): KP1 porta una cancellazione 2-nt “-CG” nell’allele G12D e una cancellazione 1-nt “-C” nell’allele Kras altrimenti wild-type (WT); e KP2 porta una cancellazione 2-nt “-GG”. Nessuno dei due cloni produce proteine Kras a lunghezza intera, indicando che tutte e tre le eliminazioni interrompono il frame di lettura Kras.

Le mutazioni di frameshift nei primi esoni sono note per innescare il decadimento mediato da nonsense (NMD) , che elimina gli MRNA con codoni di terminazione prematura. Quando abbiamo analizzato i dati di mRNA-sequencing (RNA-seq), tuttavia, abbiamo scoperto che i livelli apparenti di mRNA Kras (cioè letture di mRNA normalizzate totali) erano ridotti solo del 19% nelle cellule KP1 e del 47% nelle cellule KP2, rispetto alle cellule KP parentali (Fig. 1 ter). Entrambi i cloni hanno prodotto meno letture dell’esone 2, ma livelli normali di esone 1 e 3 letture (Fig., 1c), suggerendo che l’esone 2 potrebbe essere saltato nei cloni KP1 e KP2. Infatti, abbiamo rilevato esone 1-3 giunzione legge, indicando che esone 2 è stato saltato (Fig. 1c e file aggiuntivo 1: Figura S1b). Calcolando il rapporto tra le letture dell’esone 2 e le letture totali, abbiamo scoperto che l’esone 2 è incluso solo nel 64,0 ± 9,1% delle letture Kras da KP1-clone (Fig. 1c e Tabella 1). Simile salto dell’esone 2 è stato osservato nei cloni KP2 (file aggiuntivo 1: Figura S1c)., Concordemente, la trascrizione inversa dell’mRNA Kras seguita dalla reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) ha prodotto due prodotti: uno corrispondeva al DNA complementare Kras intatto (cDNA) e l’altro corrispondeva all’isoforma dell’esone 1-3 (Fig. 1d). L’isoforma dell’esone 1-3 mantiene un frame di lettura aperto Kras parziale che potrebbe avviare la traduzione da un codone ATG nell’esone 3 (file aggiuntivo 1: Figura S2) e produrre una proteina Kras gravemente troncata.,

La modifica di Kras non ha indotto lo splicing alternativo a livello genomico. Abbiamo identificato 97 esoni in alternativa giuntati nelle celle KP1 e 177 eventi nelle celle KP2. I cloni KP1 e KP2 hanno condiviso 22 eventi di inclusione o esclusione di cassette, con l’esclusione dell’esone Kras 2 che è il più grande cambiamento in entrambi i cloni (Fig. 1e e file aggiuntivo 1: Tabella S3). Quindi, la modifica dell’esone 2 di Kras ha indotto specificamente il salto dell’esone 2 di Kras., In particolare, mentre le trascrizioni di topo Kras G12D (GGU a GAU) non saltano l’esone 2 nelle cellule KP parentali, abbiamo scoperto che ~15% delle trascrizioni umane KRAS G12S (codone 12 GGU ad AGU) saltano l’esone 2 nella linea cellulare del cancro del polmone umano A549 (File aggiuntivo 1: Figura S1d). Non siamo stati in grado di prevedere il guadagno o la perdita di esaltatori di splice di esoni o silenziatori , ma i nostri dati suggeriscono che le sequenze vicino al codone 12 di Kras promuovono l’inclusione dell’esone 2 nel topo e nel Kras umano. Il salto degli esoni indotto dalla modifica CRISPR non era limitato alle celle Kras o KP del mouse., Uno studio recente ha dimostrato che la modifica CRISPR dell’esone FLOT1 3 nelle cellule HeLa può causare il salto dell’esone 3, esone 4 o esoni 3, 4 e 5 . Abbiamo anche rilevato un raro salto di esone quando abbiamo preso di mira l’esone 11 di LMNA nelle cellule umane HCT116 (file aggiuntivo 1: Figura S3). Saltare l’esone LMNA 11 produce una trascrizione in-frame che potrebbe essere tradotta in una proteina neomorfa.

Per esplorare ulteriormente l’idea che il salto degli esoni potrebbe produrre una trascrizione funzionale in-frame, abbiamo chiesto se la modifica mediata da CRISPR dell’esone Ctnnb1 3 potrebbe indurre il salto degli esoni e causare un fenotipo di guadagno di funzione., Esone 3 di Ctnnb1 codifica residui fosfoaccettori che promuovono la degradazione del fattore di trascrizione β-Catenina ; escissione genetica di Ctnnb1 esone 3 – che è nel telaio con esone 4-stabilizza una β-Catenina costitutivamente attiva che si accumula nel nucleo . Abbiamo progettato 11 SGRNA che mirano a regioni lungo Ctnnb1 esone 3 (Ctnnb1-sg1 a-sg11), trasdotto singoli SGRNA in cellule KP, e utilizzato high-throughput sequenziamento per analizzare l’entità della modifica presso il sito di destinazione sgRNA in ogni riga (Fig. 2b asse x, File aggiuntivo 1: Figura S4 e file aggiuntivo 2: Tabella S4)., Tre SGRNA (sg6, sg9 e sg10) hanno inefficientemente mirato a Ctnnb1. Otto degli SGRNA Ctnnb1 (da sg1 a sg5, sg7, sg8 e sg11), tuttavia, hanno indotto indel nei loro siti target con frequenze superiori al 20%. Ad esempio, Ctnnb1-sg1 ha generato inserimenti + T in circa il 65% delle letture (Fig. 2 quater). In ogni popolazione presa di mira da un forte sgRNA Ctnnb1, abbiamo rilevato tre prodotti RT-PCR che coprono esoni da 2 a 5 (Fig. 2d). Il prodotto principale corrisponde alla trascrizione normalmente impiombata che include l’esone 3. Gli altri due prodotti corrispondono a trascrizioni impiombate alternativamente: uno che salta l’esone 3 (cioè, esone 2-4 splicing, Fig. 2e) e uno che salta entrambi gli esoni 3 e 4 (cioè, esone 2-5 splicing, Fig. 2 septies). Ctnnb1 sgRNAs targeting sia DNA strand indotta esone skipping e Cas9 nucleasi attività era essenziale per esone skipping (Fig. 3 bis).

L’analisi Western blot ha rivelato che le popolazioni cellulari trasdotte con gli SGRNA forti producono una proteina β-catenina più piccola di ~74 kD che corrisponde in dimensioni a quella prevista dal prodotto di giunzione esone 2-4 (Fig. 2g). La proteina β-catenina a lunghezza intera non si è esaurita significativamente quattro giorni dopo la trasduzione. Per verificare se lo splicing alternativo dipende dall’espressione continua di Cas9 o sgRNA nei vettori lentivirali, abbiamo co-trasfettato Cas9 e Ctnnb1-sg1 o un controllo sgRNA non mirato., Sette giorni dopo la trasfezione, quando i Cas9 trasfettati e gli RNA guida dovrebbero essere esauriti, abbiamo esaminato la localizzazione della β-catenina mediante immunofluorescenza. Nelle cellule di fibroblasti di topo trasfettate con uno sgRNA di controllo non mirato, β-Catenina localizzata alle giunzioni cellulari (File aggiuntivo 1: Figura S5a). Al contrario, in molte cellule trasfettate con Ctnnb1-sg1, abbiamo rilevato β-Catenina nel nucleo (File aggiuntivo 1: Figura S5a)., Questi risultati suggeriscono che la modifica continua non è necessaria per il salto dell’esone e che il salto dell’esone 3 indotto dalla modifica mediata da CRISPR dell’esone Ctnnb1 3 produce un’isoforma β-catenina di guadagno di funzione.

Abbiamo ulteriormente analizzato trascrizioni che coprono esoni da 2 a 7 in popolazioni cellulari trattate con Ctnnb1-sg2, -sg3 e-sg5. Oltre all’isoforma a tutta lunghezza, abbiamo rilevato quattro trascrizioni con esone 2 apparentemente giuntate su ciascun esone a valle (es. esone 2-4, esone 2-5, esone 2-6 ed esone 2-7; Fig. 3 bis, lettera b)., Non comprendiamo il meccanismo di questo salto dell’esone apparentemente promiscuo indotto dalla modifica dell’esone 3 Ctnnb1, né siamo stati in grado di correlare il salto dell’esone promiscuo con specifici siti target o mutazioni indel nell’esone 3. Tuttavia, abbiamo isolato un clone modificato Ctnnb1-sg3 che suggerisce un potenziale meccanismo (file aggiuntivo 1: Figura S6a). Questo clone biallelico contiene una cancellazione di 3-bp in-frame su un allele e una grande cancellazione di 832-bp sull’altro; la cancellazione di 832-bp fonde l’estremità 5’ di intron 2 all’estremità 3’ di exon 4 (File aggiuntivo 1: Figura S6)., Abbiamo rilevato due trascrizioni in queste celle: la trascrizione correttamente impiombata che include la cancellazione 3-bp e una trascrizione che include intron 2 fuso all’esone 4 (File aggiuntivo 1: Figura S6c e Tabella 1). Questi risultati suggeriscono che l’apparente salto degli esoni rilevato nelle popolazioni di cellule modificate potrebbe riflettere i riarrangiamenti del genoma che rimuovono gli esoni.

Due esperimenti supportano l’idea che un singolo sgRNA possa indurre grandi delezioni genomiche che rimuovono gli esoni., Ad esempio, abbiamo isolato 15 cloni da cellule di topo 3T3 transitoriamente trasfettate con Cas9 e Ctnnb1-sg1 e abbiamo scoperto che quattro cloni (cioè cloni 4, 5, 13 e 15) mostravano un apparente salto di esone da RT-PCR. La PCR genomica ha rivelato riarrangiamenti del genoma in tre di questi cloni: eliminazioni di grandi dimensioni (>500 bp) e eliminazioni più piccole (~100 bp) nei cloni 4 e 15 e inserimenti di grandi dimensioni nei cloni 13 e 15 (File aggiuntivo 1: Figura S7)., Inoltre, dopo aver preso di mira l’esone 6 di p65 / RelA, abbiamo isolato un clone biallelico p65 (#15): un allele ospita un inserimento 1-nt “+A” e l’altro ospita una cancellazione 2268-bp che rimuove gli esoni 5, 6 e 7 (File aggiuntivo 1: Figura S8a, c–e). Nel clone p65 # 15, abbiamo rilevato la trascrizione completamente impiombata e un prodotto di giunzione exon 4-8 (file aggiuntivo 1: Figura S8c). Entrambi gli alleli codificano trascrizioni frameshifted ed entrambi p65 trascrizioni sono presenti a livelli inferiori rispetto WT (File aggiuntivo 1: Figura S8b)., Abbiamo anche isolato un clone p65 modificato (#31) omozigote per lo stesso inserimento + A come nel clone #15, ma il clone # 31 non produce trascrizioni impiombate alternativamente. Pertanto, la trascrizione impiombata dell’esone 4-8 nel clone #15 risulta dalla cancellazione degli esoni 5, 6 e 7. Questi grandi eventi di eliminazione degli esoni erano inaspettati e sarebbero mancati utilizzando i tipici test di screening basati su PCR.,

La capacità di causare un’attività di guadagno della funzione inducendo il salto dell’esone o l’escissione dell’esone ha suggerito che l’editing meditato da CRISPR utilizzando un singolo sgRNA potrebbe essere un modo utile per salvare parzialmente la funzione a un gene della malattia che richiede un salvataggio di basso livello. La riparazione omologa mediata da CRISPR del DNA è stata usata per correggere le mutazioni premature del codone di arresto nel gene di Dmd in un modello del topo di DMD e parecchi gruppi hanno usato CRISPR per eliminare gli esoni di Dmd e parzialmente per ristabilire l’espressione di Dmd . Abbiamo progettato quattro sgRNA / Cas9 lentivirus che mirano a diversi siti in esone 23 del gene Dmd (Fig., 4a, b) e mioblasti di topo trasdotti C2C12, una linea cellulare ampiamente utilizzata come modello per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) . Nelle cellule C2C12 trasdotte con SGRNA Dmd, abbiamo rilevato un prodotto RT-PCR che corrisponde al normale prodotto di giunzione contenente esone 23. Il sequenziamento di questi prodotti RT-PCR ha rivelato che solo Dmd-sg2 ha modificato in modo efficiente l’esone Dmd 23, come evidenziato dai picchi di sequenza misti oltre il sito di destinazione sgRNA (file aggiuntivo 1: Figura S9). Nelle cellule trasdotte con Dmd-sg2, abbiamo anche rilevato un prodotto RT-PCR corrispondente all’esone 22 giuntato all’esone 24 (Fig. 4 quater, d)., Pertanto, il targeting dell’esone 23 con uno sgRNA potrebbe essere sufficiente per indurre il salto parziale dell’esone e produrre un frame di lettura aperto della distrofina intatto. La DMD è un classico esempio di una malattia in cui una piccola quantità di restauro funzionale può fornire notevoli benefici clinici .