Sanger Sequencingとは何ですか?
“鎖終端法”としても知られるSangerシーケンシングは、1977年に英国の生化学者Frederick Sangerらによって開発されました。 この方法はDNAの部分のヌクレオチドの基盤の順序を定めるために設計されています（一般に長さが1,000bpよりより少し）。 サンガー-シークエンシング99,99%ベースの精度と言われている”金”に関する妥当性の判断のためのDNA配列を含む既知を通じて次世代シーケンサー(ゲ). サンガーシーケンシングは、ヒトゲノムプロジェクトでヒトDNAの比較的小さな断片（900bp以下）の配列を決定するために使用されました。 これらの断片は、より大きなDNA断片、最終的には染色体全体を組み立てるために使用された。
Sanger Sequencing VS NGS
NGS技術の開発により、ゲノミクス研究が加速されました。 NGSは、低入力DNAで同時に100以上の遺伝子および全ゲノムを配列することができます。, Sangerの配列は複数の顕著な利点があるので配列決定フィールドに広く利用されて残る:(i)単一の遺伝子を配列するための費用効果および(ii)99.99%正確さ、部
サンガーシーケンシングはどのように機能しますか？サンガー配列決定では、鋳型ＤＮＡ（配列決定されるＤＮＡ）に相補的なＤＮＡプライマーがＤＮＡ合成の出発点として使用される。, 四つのデオキシヌクレオチド三リン酸（dntp：A、G、C、およびT）の存在下で、ポリメラーゼは、鋳型DNA鎖に相補的なdNTPを加えることによってプライマーを拡張する。 どのヌクレオチドがヌクレオチド鎖に組み込まれているかを決定するために、別個の蛍光色素で標識された四つのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ddNTPs：ddATP、ddGTP、ddCTP、およびddTTP）を用いて合成反応を終了させる。 Dntpと比較して、ddNTPsはリボヌクレオチドから除去された酸素原子を有し、したがって次のヌクレオチドとの結合を形成することができない。, 合成後，反応生成物を多様な鎖終端ヌクレオチドに依存して単一ゲルの四つのレーンにロードし，ゲル電気泳動に供する。 それらのサイズに従って、DNAの配列が決定される。
図1. DdNTPおよびdNTPの構造。
Image credit:”Whole-genome sequencing:Figure1,”by OpenStax College,Biology).,
Sangerシーケンシングステップ
Sangerシーケンシング法は、6つのステップで構成されています:
(1)二本鎖DNA(dsDNA)は二つの一本鎖DNA(ssDNA)に変性されます。
(2)配列の一方の端に対応するプライマーが取り付けられている。
(3)四種類のdntpを有する四種類のポリメラーゼ溶液が添加されるが、一種類のddNTPのみが添加される。
(4)DNA合成反応が始まり、末端ヌクレオチドがランダムに組み込まれるまで鎖が伸びる。
(5)得られたDNA断片をssDNAに変性させる。,
(6)変性断片をゲル電気泳動により分離し、配列を決定する。
図2. 6つのステップでのサンガーシーケンシング法（ゴーティエ2008から適応）。