Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174欠損マウスは、gpr174オープンリーディングフレームを129svevbrd胚性幹細胞株（Texas A&M Institute for Genomic Medicine、TG0128）を用いてLacZ/neoカセットで置き換えるための標準 これらのGPR174欠損マウスは、C57BL/6マウスに12世代にわたってバッククロスした。 C57BL/6バックグラウンド上の関連マウスを相互交配して、GFP発現MD4マウスおよびdsRed発現GPR174十分または欠損MD4マウスを得た。, 年齢と示された性別の6と12週間の間の年齢マッチした同腹子を実験に使用した。 マウス実験のためのサンプルサイズを経験的に決定し、マウスを対照群または実験群にランダムに割り当てた。 ここで提示されたマウス実験には盲目の必要はなかった。 すべてのマウスは、特定の病原体を含まない条件下で維持し、政府および清華機関の動物ケアおよび使用委員会の動物福祉のためのガイドラインに従って使用した。,
GPR174-GFP BACトランスジェニックマウス
グリシン–グリシン–グリシン–セリン（GGGS）リンカー（四回繰り返し）と強化されたGFP（EGFP）をコードする配列は、相同組換えによってマウスBACクローンRP23-206J14におけるGPR174オープンリーディングフレームの停止コドンの直前に挿入された。 修飾したＢＡＣを精製し，受精卵の前核にマイクロインジェクトしてトランスジェニックレポーターを生成した。 血液中のGFP発現B細胞に対してスクリーニング陽性であったfounderマウスを使用して、B6マウスでさらに繁殖させ、GPR174-GFP BAC株を確立した。,
細胞培養、レトロウイルスおよびin vitro形質導入
ナイーブT細胞またはB細胞を、製造業者のプロトコルに従って、陰性CD4T細胞単離キットまたはナイーブB細胞分離キット（Miltenyi Biotec）を用いて単離した。 B細胞における標的遺伝子を過剰発現するために、精製されたB細胞を1μg ml−1リポ多糖（Sigma）で1日間活性化し、1,500gでレトロウイルス上清に2時間スピン感染させた18。
骨髄キメラの構築
B6レシピエントマウスをx線で致死的に照射した（5.,5Gy,twice)そして、3×106の性一致した骨髄細胞の静脈内移送を与え、80%μmt細胞および20%GPR174-十分または欠損細胞からなる。 キマエラは、再構成の後に六から八週間実験に使用されました。
性腺切除術
離乳後のマウスは、腹腔内にアベルチン（2.5％、0.015ml g−1体重）で麻酔した。 雌マウスの卵巣切除では，両側の卵巣を両側の背側切開によって露出させ，除去した。, 雄マウスにおける精巣切除のために，両側の睾丸を露出させ，除去するために正中腹部切開を行った。 偽操作コントロールマウスは、卵巣や睾丸を除去することなく、両側背側切開または正中腹部切開を含む手術を受けました。 外科的創開口部を縫合し，抗生物質および鎮痛薬を局所適用した。 マウスは、その後の実験の前に八週間回復させた。,
テストステロン治療
六から八週齢のマウスは、二週間のために一日おきにヒマワリ種子油に溶解したテストステロン（10mg kg-1体重）を皮下注 ビヒクル対照マウスをヒマワリ種子油のみで処理した。
養子転送、免疫およびウイルス感染
MD4B細胞による胚中心形成を測定するために、105OT-II T細胞および5×105MD4b細胞が示された遺伝子型の雄B6レシピエントに静脈内に移され、その後0で皮下免疫された。,ミョウバン中の5μgのリポ多糖および30μgのHEL–OVA共役抗原（サーモサイエンティフィック）。 HEL-OVAは、前述のようにHydraLink共役キット（SoluLink）による化学架橋によって作製された19。 SRBC免疫またはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）感染に応答して胚中心形成を測定するために、マウスは5×108SRBCs（Z.Baijiから）またはLCMVアームストロングウイルス（L.YeおよびR.Ahmedから）の2×105プラーク形成単位で腹腔内に注入した。,
MOGタンパク質免疫によるEAE
ヒトMOGの最初の120アミノ酸をコードする配列は、ヒト脳補完DNAライブラリーからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅され、pET22b+発現ベクター（Novagen）のNdeIおよびXhoIサイト間でクローニングされた。 ヒトMOGタンパク質BL21(DE3)大腸菌で発現し、そのカルボキシ末端ヒスチジン(His)タグによって精製されました。 蛋白質純度および濃度は，それぞれＳＤＳ–ＰＡＧＥおよびビシンコニン酸（ＢＣＡ）蛋白質アッセイによって評価した。 組換えタンパク質を使用するまで-80℃で保存した。, EAEを誘導するために、示されたタイプの骨髄キメラ動物は、200μgの組換えヒトMOGタンパク質を0日目に完全なフロイントアジュバントで乳化して脇 マウスは200ngの百日咳毒素（Invitrogen）を0日目および2日目に静脈内注射した。 マウスは、1日目から病気の進行のために盲目の方法で毎日監視されました。 疾患の重症度は、0、臨床徴候なし、1、麻痺した尾、2、協調運動の喪失および後肢の麻痺、2.5、一方の後肢の麻痺、3、両方の後肢の麻痺、3として採点された。,5、後肢の麻痺および前肢の衰弱;4、前肢の麻痺;および5、瀕死。 疾患の重症度を比較するために、我々は実験ごとの条件ごとに十マウスを研究し、双方向ANOVAで時間をかけて疾患スコアを分析しました。
フローサイトメトリー
抗原特異的抗体価の測定
SRBC特異的抗体価を測定するために、5×108Srbcを1mlの二重蒸留水で溶解し、15,000r.p.m.で20分間遠心, ペレットをPBSに再懸濁し、MaxiSorp enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)プレート(Nunc Maxisorp)を4℃で一晩コーティングするために使用した。MOG特異的血清抗体を測定するために、2ΜG ml-1精製組換えヒトMOGを使用してELISAプレートをコーティングした。 非特異的結合は、1％ウシ血清アルブミン（BSA）トゥイーン-20（PBST）とPBSで2時間37℃で、2×シリアル希釈1時間37℃で免疫マウスの血清サンプルのインキュベーション, プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）-共役抗マウスIgG二次抗体（1/20,000）1時間37℃でインキュベートしたプレートを洗浄し、3,3’、5、5′-テトラメチルベンジジン（TMB）で開発し、1M HClで停止した。 ブランクウェルをゼロとして設定し、450nmでの吸光度を記録した。 我々は、負のコントロールとして未免疫マウスからの血清を使用しました;カットオフ値は450nm（OD450）での光学密度2.1を掛けた負のコントロールでした。 カットオフ値以上のOD450値を有する井戸は正とみなされた。, 陽性を与えたサンプルの最も高い希薄はサンプルの力価です。
免疫組織化学によるB細胞の分布
様々な実験のために、ナイーブB細胞、1時間10μg ml−1F（ab’）2ヤギ抗マウスIgM（Jackson Immunoresearch）、またはレトロウイルスで形質導入 必要に応じて、これらの細胞は1μ mテトラメチルロダミン(TAMRA)、4-クロロメチル-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン(CMF2HC)または5-クロロメチルフルオレセインジアセテート(CMFDA)(Invitrogen)で標識された。, レシピエントマウスの脾臓または鼠径リンパ節は、1％パラホルムアルデヒドで12時間固定し、30％スクロース溶液で12時間4℃で脱水した。 染色試薬には、eFluor450-IgD（eBioscience）、APC-CD35（BD）、PE-CD3（BD）、eFluor450-B220（eBioscience）、ウサギ抗GFP（abcam）、およびAF488ヤギ抗ウサギIgG（Invitrogen）が含まれる。, スライドはProlongGold Antifade試薬（Invitrogen）と取付けられ、オリンパスFV1000直立した顕微鏡によって検査された。 画像はImaris(Bitplane)およびImageJ1.46r(National Institutes of Health)で分析した。
脾間質調製
マウス、ラットまたはブタから脾臓を繰り返しプレスし、赤血球およびリンパ球を放出するために金属メッシュに対して粉砕した。 残りの不耐性の非晶質間質組織要素をpbsで十分に洗浄した後、B27無血清培地（Invitrogen）に入れ、37℃で12時間インキュベートした。, マウスについては、三つの動物からの間質要素を1ml培地中で培養した。 ブタについては、1脾臓からの間質要素を80mlで培養した。 得られた培養物を10,000r.p.m.で60分間遠心分離して、調製培地を得、これを直ちに実験に使用するか、または使用するまで-20℃で凍結した。
Transwellアッセイ
1μg ml−1リポ多糖60時間で活性化されたB細胞は、生化学的分画から生じる異なる画分をアッセイするために使用された。, 10μg ml−1F（ab’）2ヤギ抗マウスIgM（Jackson Immunoresearch）および10μg ml-1抗CD40（クローンFGK4.5、Bio X細胞）で活性化されたナイーブB細胞またはB細胞は、CCL21誘導遊走をアッセイ 異なる遺伝子型のＢ細胞を比較したとき，各遺伝子型および治療の少なくとも三つのドナーマウスを用いて各実験においてＢ細胞を単離し，同腹子を常に用いた。 B細胞を106ミリリットル当たりの細胞で懸濁し、1％FBSを含むRPMI培地中で37℃で1時間休止した。, 次に、合計100μlの細胞懸濁液を5μm孔トランスウェル（Corning Costar）中の上部チャンバーに加え、合計150μlの誘引物質containing有溶液を下部チャンバーに加えた。 これらのソリューションは、粗マウス脾間質調製、粗ブタ脾間質調製、クロマトグラフィーからの溶出画分、組換えCCL21とCCL19（Peprotech）、または18/0LysoPS（アバンティ極性脂質）, いくつかの実験では、マウス間質条件培地に最初に5μg ml-1中和抗体マウスCCL21またはCCL19（R&Dシステム）またはヤギIgGアイソタイプコントロールの最終濃度を補充し、トランスウェルアッセイに使用される前に4℃で3時間インキュベートした。 抗体用量は、予備実験において決定されるように、100ng ml−1CCL21またはCCL19を中和するのに少なくとも十分であった。 細胞をインキュベーター内で3時間37℃で移動させた。, ボトムウェルに移動した細胞をフローサイトメトリーによって列挙し、内部計数基準として読み取る直前に既知の数の蛍光A20細胞を追加した。 それぞれの条件は、特に指示がない限り、三重ウェルで測定した。
生化学的分画
クロマトグラフィーは、Äktapurifer10高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システム（GEヘルスケア）を用いて4℃で行われ、ÄKTAmicro FPLCシステム（GEヘルスケア）を用いて行われた最後のステップを除いて行われた。, 1,200ミリリットルブタ間質条件培地の合計は、バッファーi（25ミリリットルHepes、pH7.0）と平衡アニオン交換カラム（250ミリリットルベッドボリューム）に適用され カラムを三カラム体積で洗浄した後、1M NaClを補充した三カラム体積の緩衝液Iで溶出した。 フロースルーをバッファー II（25mM Tris-HCl、pH8.5）で100mlにバッファー変更し、バッファー IIで平衡した陰イオン交換カラムに再適用した。カラムをバッファー IIの二つのカラムボリュームで洗浄し、0.1-0.5Mの線形NaCl勾配の二つのカラムボリュームで溶出した。, それぞれ10mlの画分を収集し、アリコートをトランスウェルアッセイのためにRPMI1640で緩衝液変更した。 活性画分をプールし、緩衝液IIで10mlに緩衝液を変化させ、緩衝液IIで平衡化したヘパリンカラム（5mlベッド体積）にロードし、カラムを12カラム体積の緩衝液IIで洗浄し、4カラム体積の0-2M線形NaCl勾配で溶出した。 2mlそれぞれの画分を収集し、アリコートは、トランスウェルアッセイのためのRPMI1640で緩衝変更されました。 活性画分は再びプールされ、緩衝液は0に変更された。,5mlのバッファーiとSuperdex-75カラム（24mlのベッドボリューム）にロードされたバッファーiで平衡カラムは、その後、バッファーiのワンカラムボリュームで溶出した0.5mlのそれぞれの画分を収集し、アリコートは、トランスウェルアッセイのためのRPMI1640でバッファー変更した。 活性画分をプールし、0.5mlに濃縮して、緩衝液Iで平衡化したモノSカラム（1mlベッド体積）に負荷した。カラムを12カラム体積の緩衝液Iで洗浄し、25カラム体積の0-0.5m線形NaCl勾配で溶出した。, それぞれ1mlの画分を収集し、アリコートをトランスウェルアッセイのためにRPMI1640で緩衝液変更した。 活性画分をプールし、緩衝液変更し、緩衝液Iで50μlに濃縮し、緩衝液Iで平衡化したモノSカラムに再ロードした。0.3M NaClを含む緩衝液Iの三カラム体積で洗浄し、24カラム体積の0.3-0.4M線形NaCl勾配で溶出した。, それぞれ1mlの画分を収集し、アリコートは、最も強い化学誘引性活性を含む画分を同定するために、最終的なトランスウェルアッセイのためのRPMI1640でバッファー変更された。
質量分析分析
最後の精製工程からの画分を50μlに濃縮し、12％ヌページゲル（Invitrogen）上で分析した。 ゲルは、質量分析用のＰｉｅｒｃｅ銀染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で製造業者のプロトコルに従って染色した。, 最も強い化学誘引活性を含む画分中の増加した強度のバンドを切除し、Q Exactive HF質量分析計（Thermo Fisher Scientific）で分析する前にゲル内消化を行った。 質量分析データは、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを備えたＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースを用いて分析した。
Hisタグ組換えccl21および結合アッセイ
マウスCCL21コード配列をC57BL/6マウス脾臓cDNAから増幅し、c末端Hisタグを提供するpET22b+発現ベクター（Novagen）のNdeIおよびXhoI部位間でクローニングした。, 組換えタンパク質は、BL21（DE3）マウスで発現し、そのHisタグによって精製された。 タンパク質の純度と濃度は、それぞれ、SDS–PAGEとBCAアッセイによって評価され、生物活性は、カルシウム動員アッセイを用いて検証されました。 組換えタンパク質を使用するまで-80℃で保存した。 Ccl21–HisのGPR174への結合を測定するために、陽性対照としてCCR7を用いて、293T細胞にGPR174–GFPまたはCCR7–GFP融合構築物をトランスフェクトした。, トランスフェクトされた細胞のアリコートは、CCL21–Hisタンパク質で示された濃度で37℃で30分間培養し、冷たいPBSで二回洗浄し、4％パラホルムアルデヒド PBSで洗浄した後、固定細胞をフィコエリスリン共役抗His抗体（クローンJ095G46、Biolegend）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。, 各試料中のGFP細胞は、非特異的背景染色内部対照として役立ち、対応するGFP細胞のMFIを差し引いたフィコエリトリン共役抗His抗体で染色されたGFP+
ケモカイントリガーカルシウムフラックスの測定
マウスGpr174とCcr7はPCRによって増幅され、pRK5プラスミドにクローニングされました。 HEK293T細胞は、gpr174発現、CCR7発現またはコントロールプラスミドを一時的にトランスフェクトした。, 細胞をトランスフェクション後48時間培養容器から物理的に分離し、pbsで二回洗浄し、PBS中の1μm Indo-1（Invitrogen）で37℃で30分間染色した。 PBSで二度洗浄した後、細胞を25mM Hepesおよび1％FBSを含むHanks’balanced salt solution（Invitrogen）で再懸濁し、氷上に保持した。 ケモカイン刺激を受けたとき、細胞は最初に37℃で5分のインキュベーションのための水のバッチに持ち込まれ、その後lsr IIサイトメーター（BD Biosciences）で評価され、非刺激状態のベースラインを確立した。, 細胞は、組換えCCL21 0.1ng ml−1から10μg ml−1の範囲の濃度シリーズで刺激された。 各条件の細胞を連続的に監視し、2分間記録した。 最後に、イオノマイシン（シグマ）を1μg ml−1の最終濃度で試料にさらに添加し、試料をさらに監視し、1分間記録した。 インド-1（バインド）/インド-1（フリー）比は、FlowJo（TreeStar）で分析されるように、細胞内Ca2+濃度を示すために使用されました。 イオノマイシンによって刺激された最高のCa2+濃度は、100％としてCCL21によって誘導されるカルシウム応答を正常化するために使用された。, EC50は、三パラメータ、非線形用量応答曲線をフィッティングすることによってGraphPadで推定されました。
免疫沈降およびウェスタンブロッティング
Gpr174–GFP BACトランスジェニックマウスから新たに単離されたマウスB細胞を10μg ml−1F(ab’)2ヤギ抗マウスIgMおよび10μg ml-1抗CD40 48hで活性化した。これらの活性化されたB細胞を2×107細胞/ミリリットルで1%FBSを含むRPMI培地に懸濁し、未処理または300ng ml−1CCL21で37℃で30分間刺激した。-−— 次いで、B細胞を直ちに1％NP-40溶解緩衝液中で溶解した(25mm Tris-HCl、pH7.,4、137mM NaCl、1％ノニデットP-40、20％グリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤）。 GFPタグ付きGPR174の免疫沈降のために、108B細胞のライセートを20μlのGFPトラップビーズ（ChromoTek）で一晩インキュベートした。 繰り返し洗浄した後、免疫沈降物は0.2mグリシン緩衝液（pH3.0）中で室温で10分間溶離し、次いで1M Tris-HCl（pH8.5）で中和した。 タンパク質をＳＤＳ–ＰＡＧＥで分離し，ポリビニリデン膜（ミリポア）に移した。 膜を5％BSAおよび0.1％Tween20を含有するTris緩衝生理食塩水で遮断した。, 免疫ブロッティングによって標的分子を検出するために、我々はウサギ抗GFP（Abcam）、ウサギ抗Gai-1（Abcam）、ウサギ抗Gai-2（Abcam）およびウサギ抗Ga13（Abcam）抗体を使用した。 ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体をＢｉｏｅａｓｙｔｅｃｈから購入した。 免疫ブロットを強化化学ルミネセンス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出し，画像をＩｍａｇｅｊソフトウェアで分析した。
定量的PCR
所望のタイプの細胞をFACSAria IIIで選別し、製造者の説明書に従ってRNeasy Plus MiniまたはMicro kit（Qiagen）で全RNA抽出に供した。, ＲＮＡをオールインワンＲＴマスターミックス（Ａｂｍ）で逆転写した。 定量PCRは、7500リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）上でqPCR MasterMix（Abm）を用いて行った。, Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., 異なるサンプル間の標的遺伝子の相対的発現を、ハウスキーピング遺伝子ＡｃｔｂまたはＧａｐｄｈの発現に対する正規化後に比較した。
統計データ分析
統計およびグラフ作成はPrism（Graphpad）で行った。 特に明記しない限り、両側対になっていないStudentのt検定を、異なるグループのエンドポイント平均を比較するために使用しました。
報告要約
研究デザインに関するさらなる情報は、この論文にリンクされているNature Research報告要約に記載されています。