CRISPR/Cas9を介したゲノム編集は、代替スプライシングまたはエクソン削除によってエクソンスキップを誘導します

我々は最近、KRAS G12Dから派生した二つの独立した肺腺癌細胞株におけるKRAS癌遺伝子を破壊するためにCRISPRを使用しました;p53fl/fl(KP)マウス。 我々は、エクソン2におけるフレームシフト欠失を運ぶそれぞれ二つの単一細胞クローンを単離した（図。, 1aおよび追加ファイル1：図S1a）：KP1は、G12D対立遺伝子において2-nt”-CG”欠失を有し、そうでなければ野生型（WT）Kras対立遺伝子において1-nt”-C”欠失を有し、KP2は、2-nt”-GG”欠失を有する。 でもクローン生全長Krasタンパク質を示すことをすべて削除遂行に著しい支障をKras読みます。

初期のエクソンのフレームシフト変異は、早期終了コドンを持つmrnaを排除するナンセンス媒介崩壊（NMD）をトリガ しかしながら、mRNA配列決定（RNA-seq）データを分析したところ、見かけのKras mRNAレベル（すなわち、全正規化mRNAリード）は、親KP細胞と比較して、KP1細胞では19％、KP1細胞では47％、KP2細胞でしか減少しないことが分かった（図 第1回）。 どちらのクローンもエクソン2リードは少なかったが、エクソン1と3リードの正常なレベルを生成した。, 1c)、エクソン2がKP1およびKP2クローンでスキップされる可能性があることを示唆している。 実際に、検出したエクソン1-3接合を読み込み、このエクソン2スキップした(Fig. 1cおよび追加ファイル1：図S1b）。 エクソン2読み取りと合計読み取りの比率を計算すると、エクソン2は64.0±9.1％のKRAS読み取りKP1クローンからのみ含まれていることがわかりました（ 1cおよび表1）。 同様のエクソン2スキッピングがKP2クローンで観察された（追加ファイル1：図S1c）。, 一つは無傷のKras相補的DNA（cDNA）に対応し、もう一つはエクソン1-3アイソフォームに対応していました（図。 第1回）を開催した。 エクソン1-3アイソフォームは、エクソン3（追加ファイル1：図S2）のATGコドンからの翻訳を開始し、厳しく切り捨てられたKrasタンパク質を生成すること,

Krasの編集は、ゲノム全体の代替スプライシングを誘導しなかった。 我々は97代わりにKP1細胞と177イベントKP2細胞でスプライシングエクソンを識別しました。 KP1およびKP2クローンは22のカセット包含または除外イベントを共有し、Krasエクソン2の除外は両方のクローンの最大の変化である（Fig. 1eおよび追加ファイル1:テーブルS3)。 したがって、Krasエクソン2の編集は、特にKrasエクソン2のスキップを誘発した。, 特に、マウスKras G12D（GGUからGAU）転写産物は親KP細胞においてエクソン2をスキップしないのに対し、我々は、ヒトKRAS G12S（コドン12GGUからAGU）転写産物の約15％がA549ヒト肺癌細胞株においてエクソン2をスキップすることを見出した（追加ファイル1：図S1d）。 我々は、エクソンスプライスエンハンサーまたはサイレンサーの利得または損失を予測することができませんでしたが、我々のデータは、Krasコドン12の近くのシーケ ＣＲＩＳＰＲ編集によって誘導されたエクソンスキッピングは、ＫｒａｓまたはマウスＫＰ細胞に限定されなかった。, 最近の研究では、HeLa細胞におけるFLOT1エクソン3のCRISPR編集は、エクソン3、エクソン4、またはエクソン3、4、および5のスキップを引き起こす可能性があることが示された。 また、ヒトHCT116細胞におけるLMNAのエクソン11を標的とすると、まれなエクソンスキップを検出しました（追加ファイル1：図S3）。 LMNAエクソン11をスキップすると、新形質タンパク質に翻訳することができるインフレーム転写産物を生成します。

さらにエクソンスキッピングは、機能的なインフレーム転写産物を生成することができるという考えを探求するために、我々はCTNNB1エクソン3のCRISPR媒介編集は、エクソンスキップを誘導し、ゲインの機能表現型を引き起こすかもしれないかどうかを尋ねた。, Ctnnb1のエクソン3は、β-カテニン転写因子の分解を促進するホスホ受容体残基をコードし、Ctnnb1エクソン3の遺伝的切除は、エクソン4とフレーム内にある—核に蓄積する構成的に活性なβ—カテニンを安定化させる。 11Sgrnaを設計し、Ctnnb1エクソン3(Ctnnb1-sg1-sg11)に沿った領域を標的とし、個々のsgrnaをKP細胞に形質導入し、ハイスループットシーケンシングを使用して、各行のsgrna標的部位における編集の程度を解析した(Fig. 2b x軸、追加ファイル1：図S4および追加ファイル2：表S4）。, 三つのsgrna（sg6、sg9、およびsg10）非効率的にCtnnb1を標的とした。 Ctnnb1sgRNAs（sg1sg5、sg7、sg8、およびsg11）の八は、しかし、20％を超えた周波数でそれらのターゲットサイトでインデルを誘導した。 例えば、Ctnnb1-sg1は、読み出しの約65％において+T挿入を生成した（Fig. 2）。 強いCtnnb1sgRNAによって標的とされた各集団において、我々はエクソン2から5にまたがる三つのRT-PCR産物を検出した（Fig。 2次元）。 主要な産物は、エクソン3を含む通常のスプライシングトランスクリプトに対応する。 他の二つの生成物は、代替スプライシング転写産物に対応する：エクソン3をスキップするもの（すなわち, エクソン2-4スプライシング、Fig. 2e)およびエクソン3および4の両方をスキップするもの(すなわち、エクソン2-5スプライシング、図。 2階）。 いずれかのDNA鎖を標的とするCtnnb1sgRNAsはエクソンスキッピングを誘導し、Cas9ヌクレアーゼ活性はエクソンスキッピングに不可欠であった（Fig。 3a）。

ウェスタンブロット分析により、強いsgrnaを導入した細胞集団は、エクソン2-4スプライス産物から期待されるサイズに対応する小さな-74kD β-カテニンタンパク質を産生することが明らかになった。 2）。 全長β-カテニン蛋白質は形質導入の四日後に有意に枯渇しなかった。 代替スプライシングがレンチウイルスベクターにおけるCas9またはsgRNAの連続発現に依存するかどうかをテストするために、我々はCas9とCtnnb1-sg1または非, トランスフェクション後七日、トランスフェクションCas9とガイドRnaを枯渇させる必要があるとき、我々は免疫蛍光によるβ-カテニン局在を調べた。 非標的対照sgRNAをトランスフェクトしたマウス線維芽細胞細胞において、β-カテニンは細胞接合部に局在する（追加ファイル1：図S5a）。 これに対して、Ctnnb1-sg1をトランスフェクトした多くの細胞では、核内にβ-カテニンを検出した（追加ファイル1：図S5a）。, これらの結果は、連続編集は、エクソンスキッピングのために必要とされていないことを示唆し、Ctnnb1エクソン3のCRISPR媒介編集によって誘導されるエクソン3スキッピングは、関数ゲインβ-カテニンアイソフォームを生成する。

我々はさらに、Ctnnb1-sg2、-sg3、および-sg5で処理された細胞集団におけるエクソン2-7にまたがる転写産物を分析した。 フルレングスアイソフォームに加えて、我々は明らかに各下流エクソン（すなわちエクソン2-4、エクソン2-5、エクソン2-6、およびエクソン2-7）にスプライシングエクソン2を有する四つの転写産物を検出した。 3a、b）。, 我々は、Ctnnb1エクソン3編集によって誘導されるこの明らかに無差別性エクソンスキップのメカニズムを理解していない、また我々は特定のターゲットサイトやエクソン3のindel変異と無差別性エクソンスキップを相関させることができていません。 それにもかかわらず、我々は潜在的なメカニズムを示唆するCtnnb1-sg3編集されたクローンを単離した（追加ファイル1：図S6a）。 このバイアレルクローンは、一方の対立遺伝子に3-bpインフレーム欠失と他方に大きな832-bp欠失を含み、832-bp欠失は5’イントロン2の端から3’エクソン4の端まで融合する（追加ファイル1：図S6）。, 3-bp欠失を含む適切にスプライシングされた転写産物と、イントロン2とエクソン4との融合を含む転写産物（追加ファイル1：図S6cおよび表1）。 これらの結果は、編集された細胞の集団で検出された明白なエクソンスキッピングが、エクソンを除去するゲノム再編成を反映していることを示唆

二つの実験は、単一のsgRNAがエクソンを除去する大きなゲノム欠失を誘導することができるという考えを支持する。, 例えば、我々は15クローンをマウス3T3細胞から一時的にCas9とCtnnb1-sg1をトランスフェクトし、四つのクローン（すなわちクローン4、5、13、および15）RT-PCRによって明らかなエクソンスキッピングを示したことがわかった。 大きな欠失（>500bp）と小さな欠失（-100bp）クローン4と15、およびクローン13と15（追加ファイル1：図S7）で大きな挿入。, また、p65/RelAのエクソン6をターゲットにした後、我々はbiallelic p65クローン（＃15）を単離した：一方の対立遺伝子は1-nt”+A”挿入を保有し、他方は2268-bpの削除を保有し、エクソン5、6、および7を削除する（追加ファイル1：図S8a、c–e）。 P65クローン#15では、完全にスプライシングされたトランスクリプトとエクソン4-8スプライス生成物を検出しました（追加ファイル1：図S8c）。 両方の対立遺伝子は、フレームシフトされた転写産物をコードし、両方のp65転写産物は、WTよりも低いレベルで存在する（追加ファイル1：図S8b）。, 我々はまた、編集されたp65クローン（＃31）クローン＃15と同じ+a挿入のためのホモ接合を単離したが、クローン＃31は代わりにスプライシング転写産物を生成しません。 したがって、クローン#15のエクソン4-8スプライシングトランスクリプトは、エクソン5、6、および7の欠失に起因する。 これらの大きなエクソン削除イベントが予想外にできるという話用の典型的なPCR法に基づく審査解析した。,

エクソンスキッピングまたはエクソン切除を誘導することにより、機能獲得活性を引き起こす能力は、単一のsgRNAを用いたCRISPR瞑想の編集が、低レベルのレスキューを必要とする疾患遺伝子に部分的に機能を救出するのに有用な方法であることを示唆した。 ＣＲＩＳＰＲを介した相同ＤＮＡ修復は、ＤＭＤのマウスモデルにおけるＤｍｄ遺伝子における早期停止コドン変異を修正するために使用されており、いくつかのグループは、Ｃｒｉｓｐｒを使用してＤｍｄエクソンを削除し、Ｄｍｄ発現を部分的に回復させた。 我々は、Dmd遺伝子のエクソン23の異なるサイトをターゲットに四つのsgRNA/Cas9レンチウイルスを設計しました（図。, 4a、b)および形質導入マウスC2C12筋芽細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）のモデルとして広く使用されている細胞株である。 Dmd sgrnaを導入したC2C12細胞では、エクソン23を含む通常のスプライス製品に対応するRT-PCR産物を検出しました。 これらのRT-PCR産物の配列決定により、Dmd-sg2のみがDmdエクソン23を効率的に編集し、sgrna標的部位を超えた混合配列ピークによって証明されることが明らかになった（追加ファイル1：図S9）。 Dmd-sg2を導入した細胞では、エクソン22にスプライシングされたエクソン24に対応するRT-PCR産物も検出しました（Fig. 4c、d）。, このようにエクソンを対象に23の一sgRNAが十分であるとする一部エクソン-スキッピングをそのままにdystrophin open reading frame. ＤＭＤは、少量の機能回復が実質的な臨床的利益を提供することができる疾患の古典的な例である。