Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., Myszy z niedoborem GPR174 były generowane przez standardowe procedury celowania genów, aby zastąpić otwartą ramkę odczytu Gpr174 kasetą Lacz / neo przy użyciu embrionalnej linii komórek macierzystych 129svevbrd (Texas a&m Institute for Genomic Medicine, TG0128). Te myszy z niedoborem GPR174 były krzyżowane wstecz do myszy C57BL / 6 przez 12 pokoleń. Odpowiednie myszy na tle C57BL / 6 były interbredowane w celu uzyskania myszy MD4 z ekspresją GFP i myszy MD4 z ekspresją DSRED z ekspresją GPR174-wystarczających lub niewystarczających., Do eksperymentów wykorzystano dopasowane do wieku dzieci w wieku od 6 do 12 tygodni i płci. Rozmiary próbek do eksperymentów na myszach zostały empirycznie określone, a myszy losowo przydzielono do grupy kontrolnej lub eksperymentalnej. W prezentowanych tu eksperymentach na myszach nie było potrzeby Oślepiania. Wszystkie myszy były utrzymywane w Warunkach wolnych od specyficznych czynników chorobotwórczych i były wykorzystywane zgodnie z wytycznymi rządu i Tsinghua Institutional Animal Care and Use Committee for animal welfare.,
GPR174–GFP BAC transgeniczne myszy
sekwencje kodujące dla linkera glicyna–glicyna–glicyna–seryna (GGGS) (powtórzone cztery razy) i wzmocnione GFP (EGFP) zostały wstawione bezpośrednio przed kodonem stop otwartej ramki odczytu GPR174 w klonie myszy BAC RP23-206J14 przez rekombinację homologiczną. Zmodyfikowany BAC został oczyszczony i mikroinjected do przednuklei zapłodnionej komórki jajowej do generowania transgenicznych reporterów. Mysz założycielska, która została przebadana pozytywnie pod kątem ekspresji komórek B GFP we krwi, została użyta do dalszej hodowli z myszami B6 w celu ustalenia szczepu BAC GPR174-GFP.,
hodowla komórek, retrowirusy i transdukcja in vitro
nieleczone limfocyty T lub limfocyty B zostały wyizolowane przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD4 z ujemnym wynikiem lub zestawu do izolacji limfocytów B z nieleczonym wynikiem (Miltenyi Biotec) zgodnie z protokołami producenta. W celu nadekspresji genów docelowych w komórkach B, oczyszczone komórki B były aktywowane lipopolisacharydem 1 µg ml−1 (Sigma)przez 1 dzień, przed zakażeniem spinem retrowirusowymi supernatantami w dawce 1500 g przez 2 h, zgodnie z opisem18.
Budowa Chimery szpiku kostnego
myszy biorców B6 były śmiertelnie napromieniowane promieniowaniem rentgenowskim (5.,5 Gy, dwa razy), a następnie podawano dożylnie 3 × 106 dopasowanych do płci komórek szpiku kostnego, składających się z 80% komórek µMT i 20% komórek GPR174-wystarczających lub z niedoborem. Chimera były używane do eksperymentów sześć do ośmiu tygodni po rekonstytucji.
Gonadektomia
myszy po odstawieniu od piersi były znieczulane avertyną (2,5%, 0,015 ml G−1 masy ciała) dootrzewnowo. W przypadku owariektomii samic myszy, jajniki po obu stronach zostały odsłonięte i usunięte przez obustronne nacięcia grzbietowe., W przypadku orchidektomii u samców myszy wykonano środkowe nacięcie brzucha w celu odsłonięcia i usunięcia jąder po obu stronach. Pozorowane myszy kontrolne poddano operacjom obejmującym obustronne nacięcia grzbietowe lub środkowe nacięcie brzucha bez usuwania jajników lub jąder. Chirurgiczne otwory ran były zszywane, a antybiotyki i leki przeciwbólowe były stosowane miejscowo. Myszy mogły wyzdrowieć przez osiem tygodni przed kolejnymi eksperymentami.,
leczenie testosteronem
sześć do ośmiu tygodni myszy podawano podskórnie testosteron (10 mg kg – 1 masy ciała) rozpuszczony w oleju z nasion słonecznika co drugi dzień przez dwa tygodnie. Mysz kontrolująca pojazd była leczona wyłącznie olejem z nasion słonecznika.
transfer Adopcyjny, immunizacja i zakażenie wirusowe
w celu pomiaru tworzenia się ośrodka germinalnego przez komórki B MD4, 105 komórek T OT-II i 5 × 105 komórek B MD4 o wskazanych genotypach przeniesiono dożylnie do męskich biorców B6, którzy następnie zostali uodpornieni podskórnie z 0.,5 µg lipopolisacharydu i 30 µg sprzężonego antygenu HEL–OVA w ałunu (Thermo Scientific). Hel-OVA została wytworzona przez usieciowanie chemiczne za pomocą zestawu do koniugacji HydraLink (SoluLink), jak wcześniej opisano19. Aby zmierzyć tworzenie się ośrodka germinalnego w odpowiedzi na szczepienie SRBC lub zakażenie wirusem lcmv (lymphocytic choriomeningitis virus), myszom wstrzyknięto dootrzewnowo 5 × 108 SRBCs (od Z. Baiji) lub 2 × 105 jednostek tworzących płytkę wirusa Lcmv Armstrong (od L. Ye i R. Ahmed).,
EAE poprzez uodpornienie białka MOG
Sekwencja kodująca pierwsze 120 aminokwasów ludzkiego MOG została wzmocniona przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z uzupełniającej biblioteki DNA ludzkiego mózgu i klonowana między miejscami NdeI i XhoI wektora ekspresji pET22b+ (Novagen). Ludzkie białko MOG zostało wyrażone w BL21 (DE3) Escherichia coli i oczyszczone przez jego karboksy-końcową histydynę (His) tag. Czystość i stężenie białka oceniano odpowiednio za pomocą testu SDS-PAGE i testu białka kwasu bicynchonicznego (BCA). Rekombinowane białka były przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia., W celu wywołania EAE, szpik kostny-chimeryczne zwierzęta wskazanego typu były uodpornione podskórnie na bok 200 µg rekombinowanego ludzkiego białka MOG emulgowanego w pełnym adiuwancie Freunda w dniu 0. Myszom podawano dożylnie 200 ng toksyny krztuścowej (Invitrogen) w dniach 0 i 2. Myszy były monitorowane codziennie w sposób ślepy pod kątem progresji choroby od dnia 1. Nasilenie choroby oceniono w następujący sposób: 0, brak objawów klinicznych; 1, sparaliżowany Ogon; 2, utrata skoordynowanego ruchu i niedowład tylnych kończyn; 2,5, paraliż jednej kończyny tylnej; 3, paraliż obu kończyn tylnych; 3.,5, paraliż obu kończyn tylnych i osłabienie kończyn przednich; 4, paraliż kończyn przednich; i 5, konający. Aby porównać nasilenie choroby, zbadaliśmy dziesięć myszy na stan na eksperyment i przeanalizowaliśmy wyniki choroby w czasie za pomocą dwukierunkowej ANOVA.
cytometria przepływowa
pomiar mian przeciwciał swoistych dla antygenu
aby zmierzyć mian przeciwciał swoistych dla SRBC, lysed 5 × 108 SRBCs z 1 ml podwójnie destylowanej wody i odwirowaliśmy je przy 15 000 obr. / min., Granulat wymieszano w PBS i użyto do pokrycia płytek MaxiSorp enzymatycznie związanych z testem immunologicznym (ELISA) (Nunc Maxisorp) przez noc w temperaturze 4 °C. Aby zmierzyć swoiste przeciwciała w surowicy MOG, użyliśmy 2 µg ml-1 oczyszczonego rekombinowanego ludzkiego MOG do pokrycia płytek ELISA. Niespecyficzne Wiązanie zostało zablokowane 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS z użyciem Tween-20 (Pbst) przez 2 h w temperaturze 37 °C, a następnie inkubacja z 2× seryjnymi rozcieńczeniami próbek surowicy uodpornionych myszy przez 1 h w temperaturze 37 °C., Płytki przemyto i inkubowano sprzężonym przeciwciałem wtórnym IgG przeciwko peroksydazie chrzanu (HRP) (1/20 000) przez 1 h w temperaturze 37 °C. płytki przemyto, wytworzono z 3,3′, 5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) i zatrzymano z 1 m HCl. Ustawiliśmy puste studnie jako zero, i zarejestrowaliśmy absorbancję na 450 nm. Jako ujemną kontrolę wykorzystaliśmy surowice nieimmunizowanych myszy; wartością odcięcia była gęstość optyczna przy 450 nm (OD450) ujemnej kontroli pomnożona przez 2,1. Studnia o wartości OD450 nie mniejszej niż wartość odcięcia została uznana za dodatnią., Najwyższym rozcieńczeniem próbki, które dało dodatni wynik, jest miano próbki.
Dystrybucja komórek B przez immunohistochemię
w różnych eksperymentach, naiwne komórki B, komórki B aktywowane przez 1 h z 10 µg ml−1 F(ab')2 kozy anty-myszy IgM (Jackson Immunoresearch), lub komórki B transdukowane retrowirusem zostały przeniesione do biorców B6. W razie potrzeby komórki te były znakowane tetrametylorhodaminą 1 µM (TAMRA), 4-chlorometylo-6,8-difluoro-7-hydroksykumaryną (CMF2HC) lub dioctanem 5-chlorometylfluoresceiny (CMFDA) (Invitrogen)., Śledziony lub pachwinowe węzły chłonne myszy biorcy zostały ustalone 1% paraformaldehydem przez 12 h, a następnie odwodnione w 30% roztworze sacharozy przez 12 h w temperaturze 4 °C. Aby zapewnić maksymalną reprezentację różnych regionów narządów w końcowym zbiorze danych, przetwarzaliśmy niekonsekutywne sekcje tkanek i barwiliśmy je wskazanymi przeciwciałami. Odczynniki barwienia obejmowały eFluor450-IgD( eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), królik anty-GFP (abcam) i AF488 Kozioł anty-Królik IgG (Invitrogen)., Szkiełka zamontowano za pomocą ProlongGold Antifade reagent (Invitrogen)i zbadano za pomocą mikroskopu pionowego Olympus FV1000. Obrazy analizowano za pomocą Imaris (Bitplane) i ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
preparat zrębu śledziony
śledziony myszy, szczurów i świń były wielokrotnie prasowane i mielone o metalową siatkę, aby uwolnić czerwone krwinki i limfocyty. Pozostałe niezauważalne, amorficzne elementy tkanki zrębowej zostały dokładnie przemyte PBS przed umieszczeniem w pożywce wolnej od surowicy B27 (Invitrogen) i inkubowane w temperaturze 37 °C przez 12 godzin., W przypadku myszy elementy stromalne z trzech zwierząt hodowano w pożywce o pojemności 1 ml. W przypadku świń elementy stromalne z 1 śledziony hodowano w 80 ml. Wynikowa kultura była odwirowana przy 10 000 obr. / min przez 60 min w celu uzyskania kondycjonowanego medium, które było albo natychmiast używane do eksperymentów, albo zamrożone w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
test Transwella
limfocyty B aktywowane lipopolisacharydem 1 µg ml−1 przez 60 h były używane do oznaczania różnych frakcji wynikających z frakcjonowania biochemicznego., Do badania migracji indukowanej CCL21 użyto wcześniej nieleczonych limfocytów B lub limfocytów B aktywowanych 10 µg ml−1 F(ab')2-mysim IgM (Jackson Immunoresearch) i 10 µg mL−1-CD40 (clone FGK4.5, Bio X Cell). Kiedy porównywano komórki B o różnych genotypach, co najmniej trzy myszy dawców każdego genotypu i leczenia były używane do izolowania komórek B w każdym eksperymencie, a littermates były zawsze używane. Komórki B zawieszono w temperaturze 106 komórek na mililitr i spoczęły w pożywce RPMI zawierającej 1% FBS w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę., Następnie do górnej komory dodano 100 µl zawiesiny komórkowej w transwelu o porach 5 µm (Corning Costar), a do dolnej komory dodano 150 µl roztworów zawierających Atraktant. Roztwory te obejmowały podłoże hodowlane uwarunkowane surowym preparatem zrębu śledziony myszy, podłoże hodowlane uwarunkowane surowym preparatem zrębu śledziony świń, frakcje elucyjne z chromatografii, podłoże hodowlane zawierające rekombinowane CCL21 i CCL19 (Peprotech) lub 18/0 Lizopów (Avanti Polar Lipids) o wskazanych stężeniach., W niektórych eksperymentach podłoże uwarunkowane stromą mysią najpierw uzupełniono końcowym stężeniem 5 µg przeciwciał neutralizujących ml−1 przeciwko mysim CCL21 lub CCL19 (układ R&D) lub kontroli izotypu IgG u kóz i inkubowano w temperaturze 4 °C przez 3 godziny przed zastosowaniem do testu transwella. Dawka przeciwciał była co najmniej wystarczająca do zneutralizowania 100 ng ml−1 CCL21 lub CCL19, jak określono we wstępnych eksperymentach. Komórki mogły przenosić się przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze., Komórki, które migrowały do studni dennych, były wyliczane za pomocą cytometrii przepływowej, z fluorescencyjnymi komórkami A20 o znanych liczbach dodawanymi bezpośrednio przed odczytem jako wewnętrzny standard liczenia. Każdy warunek był mierzony w studzienkach potrójnych, o ile nie zaznaczono inaczej.
frakcjonowanie biochemiczne
chromatografię przeprowadzono przy użyciu systemu szybkiej białkowej chromatografii cieczowej ÄKTApurifer 10 (Fplc) (GE Healthcare) w temperaturze 4 °c, z wyjątkiem ostatniego etapu, który przeprowadzono przy użyciu systemu ÄKTAmicro FPLC (GE Healthcare)., Na kolumnę wymiany anionów (objętość łoża 250 ml) równomiernie z buforem I (Hepes 25 mm, pH 7,0) nałożono 1200 ml pożywki ze stromą świnią. Kolumna była myta trzema kolumnami objętości przed wymazaniem trzema kolumnami objętości buforu i uzupełniona o 1 M NaCl. Przepływ został zmieniony buforem Ii (25 mM Tris-HCl, pH 8,5) na 100 ml i ponownie nałożony na kolumnę wymiany anionów równoważoną z buforem II. kolumnę przemyto dwoma kolumnami bufora II i eluowano dwiema kolumnami o gradiencie liniowym NaCl 0,1-0,5 M., Zebrano frakcje po 10 ml każda, a alikwoty zmieniono buforem za pomocą RPMI 1640 W teście transwella. Frakcje aktywne połączono i zmieniono bufor do 10 ml z buforem II i załadowano na kolumnę heparyny (objętość łoża 5 ml) równoważoną buforem II. kolumnę przemyto 12 kolumnową objętością bufora II i eluowano 4 kolumnową objętością liniowego gradientu NaCl 0-2 M. Zebrano frakcje po 2 ml każda, a alikwoty zmieniono buforem za pomocą RPMI 1640 W teście transwella. Aktywne ułamki zostały ponownie połączone, bufor-zmieniono na 0.,5 ml buforu I i załadowano na kolumnę Superdex-75 (objętość łoża 24 ml) równoważoną buforem I. kolumnę wymazano z jednokolumnową objętością buforu I. zebrano frakcje po 0,5 ml każda, a aliquoty zmieniono buforem za pomocą rpmi 1640 dla testu transwella. Frakcje aktywne połączono i zagęszczono do 0,5 ml w celu załadowania na kolumnę Mono S (objętość łoża 1 ml) równoważoną buforem I. kolumnę przemyto 12 kolumnami bufora i i eluowano 25 kolumnami o gradiencie liniowym NaCl 0-0, 5 M., Zebrano frakcje po 1 ml każda, a alikwoty zmieniono buforem za pomocą RPMI 1640 W teście transwella. Frakcje aktywne zostały połączone, zmienione buforem i zagęszczone do 50 µl za pomocą bufora i, a następnie ponownie załadowane na kolumnę Mono s równoważoną buforem I. kolumnę przemyto trzema kolumnami bufora i zawierającymi 0,3 M NaCl, i eluowano 24 kolumnami o gradiencie liniowym NaCl 0,3–0,4 m., Zebrano frakcje po 1 ml każda, a podliczniki zmieniono buforem RPMI 1640 dla końcowego testu transwella w celu identyfikacji frakcji, która zawierała najsilniejszą aktywność chemioatrakcyjną.
analiza spektrometrii mas
frakcje z ostatniego etapu oczyszczania zagęszczono do 50 µl i poddano analizie na 12% żelach do żeli ślubnych (Invitrogen). Żele barwiono srebrną plamą Pierce ' a do spektrometrii mas (Thermo Fisher Scientific) zgodnie z protokołem producenta., Pasma o zwiększonej intensywności we frakcji zawierającej najsilniejszą aktywność chemioatrakcyjną zostały wycięte i poddane trawieniu w żelu przed analizą spektrometrem masowym Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific). Dane ze spektrometrii masowej analizowano za pomocą bazy danych Swissprot z wyszukiwarką MASCOT.
his-tagged recombinant CCL21 and binding assay
Sekwencja kodowania CCL21 myszy została amplifikowana z cDNA śledziony myszy C57BL/6 i klonowana między miejscami NdeI i XhoI wektora ekspresji pET22b+ (Novagen), który zapewnia C-terminal his tag., Rekombinowane białko zostało wyrażone w myszach BL21 (DE3) i oczyszczone przez jego tag His. Czystość i stężenie białka oceniano odpowiednio za pomocą testu SDS-PAGE i BCA, a bioaktywność weryfikowano za pomocą testu mobilizacyjnego wapnia. Rekombinowane białka były przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Aby zmierzyć Wiązanie CCL21–His z GPR174, z CCR7 jako kontrolą pozytywną, komórki 293T zostały przetransferowane za pomocą konstrukcji fuzji GPR174–GFP lub CCR7–GFP., Następnie przez 30 minut inkubowano białko CCL21–His we wskazanym stężeniu w temperaturze 37 °C, dwukrotnie przemywano zimnym PBS i natychmiast utwardzano 4% paraformaldehydem. Po umyciu w PBS, stałe komórki zostały zabarwione przeciwciałem przeciw His sprzężonym z fikoerytryną (klon J095G46, Biolegend) i poddane analizie cytometrii przepływowej., Komórki GFP w każdej próbce służyły jako niespecyficzna Kontrola wewnętrzna barwienia tła, a średnia intensywność fluorescencji (mfi) komórek GFP+ zabarwionych przeciwciałem anty-His sprzężonym z fikoerytryną, z MFI odpowiednich komórek GFP odejmowanych, została użyta do ilościowego określenia specyficznego wiązania CCL21.
Mysz Gpr174 i Ccr7 zostały amplifikowane przez PCR i sklonowane do plazmidu pRK5. Komórki HEK293T zostały przejściowo przetransferowane z ekspresją GPR174, ekspresją CCR7 lub plazmidem kontrolnym., Komórki zostały fizycznie odłączone od naczynia hodowlanego 48 godzin po transfekcji, dwukrotnie przemyte PBS i zabarwione 1 µM Indo-1 (Invitrogen) w PBS w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po dwukrotnym przemyciu PBS, komórki wymieszano z wyważonym roztworem soli Hanksa (Invitrogen) zawierającym 25 mm Hepes i 1% FBS i trzymano w lodzie. Po poddaniu stymulacji chemokinami komórki najpierw wprowadzano do partii wody w temperaturze 37 °C przez 5 minut inkubacji, a następnie oceniano za pomocą cytometru LSR II (BD Biosciences) w celu ustalenia wartości wyjściowej dla stanu niestymulowanego., Komórki stymulowano serią stężeń rekombinowanego CCL21 w zakresie od 0,1 ng ml-1 do 10 µg ml-1. Komórki w każdym stanie były stale monitorowane i rejestrowane przez 2 min. Na końcu jonomycyna (Sigma) została dodana do próbki w końcowym stężeniu 1 µg ml−1, a próbka była dalej monitorowana i rejestrowana przez 1 min. Współczynniki Indo-1(związany)/Indo-1(wolny) zostały użyte do wskazania wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+, analizowanego w badaniu FlowJo (TreeStar). Najwyższe stężenie Ca2 + stymulowane jonomycyną zostało użyte w 100% do normalizacji odpowiedzi wapnia indukowanej przez CCL21., EC50 oszacowano w GraphPad, dopasowując trzyparametrową, nieliniową krzywą dawka-odpowiedź.
Immunoprecypitacja i Western blotting
świeżo wyizolowane komórki B myszy z transgenicznych myszy GPR174–GFP BAC zostały aktywowane 10 µg ml−1 F(ab')2 kozy anty-myszy IgM i 10 µg ml−1 Anty-CD40 przez 48 h. te aktywowane komórki B zostały następnie zawieszone w 2 × 107 komórek na mililitr w pożywce RPMI zawierającej 1% FBS, i pozostawione nieleczone lub stymulowane z 300 ng ml−1 ccl21 w temperaturze 37 °C przez 30 min. Limfocyty B zostały następnie natychmiast lyzowane w 1% buforze lizy NP-40 (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glicerol i inhibitory proteazy). Dla immunoprecypitacji gpr174 oznaczonej GFP, lizaty 108 komórek B inkubowano przez noc z 20 µl paciorków GFP–Trap (ChromoTek). Po wielokrotnym myciu immunoprecypitaty eluowano przez inkubację w 0,2 M buforze glicyny (pH 3,0) przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie neutralizowano 1 M Tris-HCl (pH 8,5). Białka zostały oddzielone przez SDS-PAGE i przeniesione do membrany poliwinylidenowej (Millipore). Membrany zostały zablokowane roztworem soli fizjologicznej buforowanej Tris zawierającym 5% BSA i 0,1% Tween 20., Aby wykryć cząsteczki docelowe przez immunoblotting, użyliśmy przeciwciał anty-GFP królików (Abcam), anty-Gai-1 królików (Abcam), anty-Gai-2 królików (Abcam) i anty-Ga13 królików (Abcam). HRP-skoniugowane przeciwciało przeciwko królikowi zostało zakupione od firmy Bioeasytech. Immunobloty wykrywano przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji (Thermo Fisher Scientific), a obrazy analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ.
ilościowe PCR
komórki pożądanego typu zostały posortowane za pomocą FACSAria III i poddane całkowitej ekstrakcji RNA za pomocą RNeasy Plus Mini lub Micro kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta., RNA został przepisany w odwrotnej transkrypcji za pomocą All-In-One RT MasterMix (Abm). Ilościowy PCR został wykonany z qPCR MasterMix (Abm) na systemie PCR w czasie rzeczywistym 7500 (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., Po normalizacji porównano relatywną ekspresję genów docelowych w różnych próbkach z ekspresją genów actb lub Gapdh.
Analiza danych statystycznych
statystyki i wykresy przeprowadzono w Prism (Graphpad). O ile nie zaznaczono inaczej, do porównania punktów końcowych różnych grup użyto dwuogoniastych, nieparowanych testów t Studenta.
Podsumowanie Raportu
Więcej informacji na temat projektu badawczego można znaleźć w podsumowaniu raportu raportu z badań przyrodniczych powiązanym z niniejszym artykułem.