czym jest sekwencjonowanie Sangera?
sekwencjonowanie Sangera, znane również jako „metoda zakończenia łańcucha”, zostało opracowane przez angielskiego biochemika Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 roku. Metoda ta jest przeznaczona do określania sekwencji zasad nukleotydowych w kawałku DNA (zwykle poniżej 1000 bp długości). Sanger z 99.,99% dokładność bazowa jest uważana za „złoty standard” dla walidacji sekwencji DNA, w tym tych już zsekwencjonowanych przez sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Sanger sekwencjonowanie był używany w Human Genome projekt wyznaczać sekwencje stosunkowo małe fragmenty ludzkiego DNA (900 bp lub mniej). Fragmenty te były używane do montażu większych fragmentów DNA, a ostatecznie całych chromosomów.
sekwencjonowanie Sangera VS NGS
rozwój technologii NGS przyspieszył badania nad genomiką. NGS może jednocześnie sekwencjonować ponad 100 genów i całe genomy z NISKOWEJŚCIOWYM DNA., Sanger sekwencjonowanie pozostaje szeroko stosowany w dziedzinie sekwencjonowania, ponieważ oferuje kilka wybitnych korzyści: (i) opłacalność dla sekwencjonowania pojedynczych genów i (ii) 99.99% dokładność, szczególnie nadaje się do weryfikacji sekwencjonowania dla site-directed mutagenesis lub klonowane wkładki.
Jak działa sekwencjonowanie Sangera?
w sekwencjonowaniu Sangera, primer DNA uzupełniający wzór DNA (DNA do sekwencjonowania) jest używany jako punkt wyjścia do syntezy DNA., W obecności czterech trójfosforanów deoksynukleotydów (dNTPs: A, G, C i T) polimeraza rozszerza Grunt, dodając uzupełniający dNTP do nici wzorcowej DNA. Aby określić, który nukleotyd jest włączony do łańcucha nukleotydów, cztery trifosforany dideoksynukleotydu (ddatp, ddGTP, ddCTP i ddTTP) oznaczone wyraźnym fluorescencyjnym barwnikiem są używane do zakończenia reakcji syntezy. W porównaniu do dNTPs, ddNTPs ma atom tlenu usunięty z rybonukleotydu, dlatego nie może tworzyć połączenia z następnym nukleotydem., Po syntezie produkty reakcji są ładowane do czterech pasów pojedynczego żelu w zależności od zróżnicowanego nukleotydu kończącego łańcuch i poddawane elektroforezie żelowej. W zależności od ich wielkości określa się w ten sposób sekwencję DNA.
Rysunek 1. Struktura ddNTP i dNTP.
Image credit: „whole-genome sequencing: Figure 1,” by OpenStax College, Biology).,
etapy sekwencjonowania Sangera
metoda sekwencjonowania Sangera składa się z 6 etapów:
(1) dwuniciowy DNA (dsDNA) jest denaturowany do dwóch jednoniciowych DNA (ssDNA).
(2) dołącza się element odpowiadający jednemu końcowi sekwencji.
(3) dodaje się cztery roztwory polimerazy z czterema typami dNTPs, ale dodaje się tylko jeden typ ddNTP.
(4) rozpoczyna się reakcja syntezy DNA, a łańcuch rozciąga się aż do momentu, gdy nukleotyd zakończenia zostanie losowo przyłączony.
(5) powstałe fragmenty DNA są denaturowane do ssDNA.,
(6) denaturowane fragmenty są oddzielane elektroforezą żelową i wyznacza się ich sekwencję.
Rysunek 2. Metoda sekwencjonowania Sangera w 6 krokach (zaadaptowana z Gauthier 2008).