niedawno używane CRISPR zakłócić Kras oncogene w dwóch niezależnych linii komórkowych gruczolakoraka płuc , które zostały pochodzące z Kras G12D; p53 FL/FL (KP) myszy . Wyizolowaliśmy dwa klony jednokomórkowe, z których każdy ma delecje zmiennoprzecinkowe w egzonie 2 (rys., 1A i dodatkowy plik 1: Rysunek S1a): KP1 nosi delecję 2-nt „-CG” w allelu G12D i delecję 1-nt „-C” w allelu Kras typu dzikiego (WT); A KP2 nosi delecję 2-nt „-GG”. Żaden klon nie wytwarza pełnowymiarowego białka Kras, co wskazuje, że wszystkie trzy delecje zakłócają ramkę odczytu Kras.
sgRNA schemat sgRNA ukierunkowany na ekson 2 genu mysi Kras (sgKras)., Czerwony grot oznacza Miejsce dekoltu Cas9. Linie komórkowe KP1 i KP2 były transdukowane za pomocą lentivirusa kodującego Cas9 i sgKras. Dwa klony jednokomórkowe (klon KP1 i klon KP2) mają możliwość usunięcia frameshift. Czarne strzałki wskazują pozycje starterów reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkrypcji (RT-PCR). Kodon G12D jest podkreślony. B znormalizowany Kras odczytuje liczby z analizy sekwencjonowania RNA (RNA-seq) komórek rodzicielskich KP (niebieski) i klonów KP (czerwony). RNA-seq wykonano dwa razy dla klonu KP2 i trzy razy dla pozostałych grup. „+”oznacza allel WT., c RNA-seq wykazujący częściowy ekson 2 w Klonach KP1. Liczby RNA-seq oznaczają odczyty obejmujące wskazane węzły egzonowe. Przedstawiono dwa reprezentatywne replikaty biologiczne. d RT-PCR Analiza Kras mRNA wykrywa ekson 2. Spodziewane rozmiary pasma to 331 bp i 209 bp. M, marker molekularny. „*”oznacza indele w produktach PCR z klonów. e Wykres punktowy pokazujący 22 zdarzenia exon, które zmieniają się zarówno w Klonach KP1, jak i KP2. Wykluczenie egzonu Kras 2 jest najczęstszym zdarzeniem., Ψ , procentowy indeks splicingu
mutacje Frameshift we wczesnych egzonach wywołują rozpad nonsensopediowany (NMD), który eliminuje mRNA z kodonami przedwczesnego zakończenia. Kiedy analizowaliśmy dane z sekwencjonowania mRNA (RNA-seq), okazało się jednak, że pozorne poziomy mRNA Kras (tj. całkowite znormalizowane odczyty mRNA) były zmniejszone tylko o 19% w komórkach KP1 i 47% w komórkach KP2, w porównaniu z rodzicielskimi komórkami KP (rys. 1b). Oba klony produkowały mniej odczytów egzonu 2, ale normalne poziomy odczytów egzonu 1 i 3 (rys., 1C), sugerując, że exon 2 może być pominięty w Klonach KP1 i KP2. Rzeczywiście, wykryliśmy odczyty złączy exon 1-3, co wskazuje, że exon 2 został pominięty (rys. 1c i dodatkowy plik 1: Rysunek S1b). Obliczając stosunek odczytów eksonu 2 do odczytów całkowitych, odkryliśmy, że ekson 2 jest zawarty w zaledwie 64,0 ± 9,1% odczytów Kras z klonu KP1 (rys. 1c i Tabela 1). Podobne przeskoki eksonu 2 zaobserwowano w Klonach KP2( dodatkowy plik 1: Rysunek S1c)., Zgodnie, odwrotna transkrypcja mRNA Kras, a następnie reakcja łańcuchowa polimerazy (RT-PCR), dała dwa produkty: jeden odpowiadał nienaruszonemu Komplementarnemu DNA Kras (cDNA), a drugi odpowiadał izoformie eksonu 1-3 (rys. 1d). Izoforma egzonu 1-3 zachowuje częściową otwartą ramkę odczytu Kras, która może zainicjować translację z kodonu ATG w egzonie 3 (dodatkowy plik 1: Rysunek S2) i wytworzyć mocno obcięte białko Kras.,
edytowanie Kras nie wywołało alternatywnego splicingu genomu. Zidentyfikowaliśmy 97 alternatywnie splicowanych eksonów w komórkach KP1 i 177 zdarzeń w komórkach KP2. Klony KP1 i KP2 dzieliły 22 zdarzenia włączenia lub wykluczenia kasety, przy czym wykluczenie Kras exon 2 jest największą zmianą w obu klonach(rys. 1e i dodatkowy plik 1: Tabela S3). W ten sposób edytowanie eksonu Kras 2 wywołało specjalnie pominięcie eksonu Kras 2., W szczególności, podczas gdy transkrypty myszy Kras G12D (GGU do GAU) nie pomijają eksonu 2 w rodzicielskich komórkach KP, odkryliśmy, że ~15% ludzkich transkryptów KRAS G12S (kodon 12 GGU do AGU) pomija ekson 2 w linii komórek ludzkiego raka płuc a549 (dodatkowy plik 1: Rysunek S1d). Nie byliśmy w stanie przewidzieć zwiększenia lub utraty wzmacniaczy lub tłumików eksonu , ale nasze dane sugerują, że sekwencje w pobliżu kodonu Kras 12 promują włączenie eksonu 2 do mysich i ludzkich Kras. Egzonimy wywołane edycją CRISPR nie ograniczały się do Kras ani do komórek KP myszy., Ostatnie badania wykazały, że edycja CRISPR FLOT1 exon 3 w komórkach HeLa może powodować pomijanie exon 3, exon 4 lub exons 3, 4 i 5 . Wykryliśmy również rzadkie pomijanie eksonu, gdy celowaliśmy w ekson 11 LMNA w ludzkich komórkach HCT116 (dodatkowy plik 1: Rysunek S3). Pomijając lmna exon 11 tworzy in-frame transcript, który może być przetłumaczony na białko neomorficzne.
aby dokładniej zbadać pomysł, że pomijanie eksonu może produkować funkcjonalny transkrypt w ramce, zapytaliśmy, czy edycja za pośrednictwem CRISPR eksonu 3 ctnnb1 może wywołać pomijanie eksonu i spowodować fenotyp funkcji., Ekson 3 Ctnnb1 koduje pozostałości fosfoakceptorów, które sprzyjają degradacji czynnika transkrypcyjnego β-kateniny ; genetyczne wycięcie eksonu 3 Ctnnb1—który znajduje się w ramce z eksonem 4-stabilizuje konstytutywnie aktywną β-Kateninę, która gromadzi się w jądrze . Zaprojektowaliśmy 11 sgrna, które celują w regiony wzdłuż ctnnb1 exon 3 (ctnnb1-sg1 do-sg11), przetransferowaliśmy pojedyncze sgrna do komórek KP i wykorzystaliśmy sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości do analizy stopnia edycji w miejscu docelowym sgRNA w każdej linii (rys. 2B oś x, dodatkowy plik 1: Rysunek S4 i dodatkowy plik 2: Tabela S4)., Trzy sgrna (sg6, sg9 i sg10) nieefektywnie ukierunkowane na Ctnnb1. Jednakże osiem sgRNAs ctnnb1 (sg1 do sg5, sg7, sg8 i sg11) wywołało indele w miejscach docelowych z częstością przekraczającą 20%. Na przykład ctnnb1-sg1 generował wstawki + T w około 65% odczytów (rys. 2c). W każdej populacji, której celem jest silny ctnnb1 sgRNA, wykryliśmy trzy produkty RT-PCR, które obejmują eksony od 2 do 5 (rys. 2d). Główny produkt odpowiada normalnie splatanej transkrypcji, która zawiera ekson 3. Pozostałe dwa produkty odpowiadają alternatywnie splatanym stenogramom: jeden, który pomija exon 3 (tj., exon 2-4 splicing, rys. 2e) i jeden, który pomija oba egzony 3 i 4 (tj. exon 2-5 splicing, rys. 2f). Ctnnb1 sgRNAs ukierunkowany albo nici DNA indukowane exon pomijanie i aktywność nukleazy Cas9 był istotny dla exon pomijanie (rys. 3a).
ctnnb1 sgRNAs schemat genu Ctnnb1. Egzon 3 koduje domenę hamującą: aminokwasy fosforylacyjne 33, 37, 41 i 45 sprzyjają degradacji białka β-kateniny., Utrata egzonu 3 stabilizuje β-Kateninę. Jedenaście sgRNAs zostało zaprojektowanych tak, aby celować w ekson 3: odpowiednio silne sgRNAs w kolorze czerwonym i słabe sgRNAs w kolorze czarnym. sgrna, które używają „NGG” PAM są pokazane powyżej eksonu 3, a te, które używają” CCN ” PAM są pokazane poniżej eksonu 3. b korelacja między eksonem 3 a efektywnością sgRNA. Indele genomowe były mierzone przez głębokie sekwencjonowanie. Komórki KP zostały zakażone lentivirusem. Exon 3 Indele sg11 nie zostały określone. sgRNAs, które indukują> 20% indeli są zaznaczone na Czerwono., rozkład C indeli sg1 pokazuje, że wstawianie T (+T) w miejscu rozszczepienia nukleotydu 97 eksonu 3 (red arrowhead) było najczęstsze. Sekwencja PAM jest niebieska. d RT-PCR z użyciem podkładów obejmujących eksony 2 i 5 wykazuje częściowe pominięcie eksonu. Marker molekularny M. sgGFP jest kontrolnym sgRNA. Exon 3 przeskakujące pasma zostały skwantyfikowane za pomocą oprogramowania ImageQuant TL i znormalizowane do pełnych pasm cDNA. sg4 wykazywał widoczne słabe pasma, których nie można było określić ilościowo., e, F klonowanie TOPO i sekwencjonowanie Sangera potwierdziły, że dwa główne dolne pasma RT-PCR w (c) są alternatywnym splicingiem odpowiednio eksonu 2-4 i eksonu 2-5. g Western blot analiza β-kateniny. Pełna długość β-kateniny wynosi ~86 kD. β-katenina bez eksonu 3 (delta exon 3) wynosi ~77 kDa. Actin służył jako kontrola ładowania
aktywność nukleazy Cas9 wymagana do pominięcia jednego lub więcej egzonów., analiza RT-PCR mRNA Ctnnb1 w komórkach KP transducted z lentiviruses które kodują sgCtnnb1. 2 i nuclease defective Cas9( dCas9), dcas9-KRAB fusion, lub WT Cas9. RT-PCR wykonano przy użyciu primerów w eksonach 2 i 7 na transdukowanych populacjach komórek KP po selekcji puromycyny i sortowaniu FACS. Pokazano Długość egzonu i fazę ramki odczytu. Tylko produkt splotu egzonu 2-4 zachowuje sekwencję kodującą β-Kateninę. b RT-PCR Analiza mRNA Ctnnb1 w komórkach KP transducted z lentiviruses które kodują Cas9 i sgGFP, sg3 lub sg5., „- „, nieleczone
Analiza Western blot wykazała, że populacje komórek transdukowane silnymi sgrna wytwarzają mniejsze ~74 kD białka β-kateniny, które odpowiada wielkości oczekiwanej z produktu splotu eksonu 2-4 (rys. 2g). Pełnowymiarowe białko β-kateniny nie zostało znacząco wyczerpane cztery dni po transdukcji. Aby sprawdzić, czy alternatywny splicing jest zależny od ciągłej ekspresji Cas9 lub sgRNA w wektorach lentiwiralnych, współwystępujemy Cas9 i Ctnnb1-sg1 lub niekontrolowaną kontrolą sgRNA., Siedem dni po transfekcji, kiedy transfektowany Cas9 i przewodnik RNA powinny być wyczerpane, zbadaliśmy lokalizację β-kateniny przez immunofluorescencję. W komórkach mysich fibroblastów transfekcyjnych z niecelowaną kontrolą sgRNA, β-katenina zlokalizowana na węzłach komórkowych (dodatkowy plik 1: Rysunek S5a). Natomiast w wielu komórkach przetaczanych Ctnnb1-sg1 wykryto β-Kateninę w jądrze (dodatkowy plik 1: Rysunek S5a)., Wyniki te sugerują, że ciągłe edytowanie nie jest wymagane do pomijania eksonu i że pomijanie eksonu 3 wywołane edycją za pośrednictwem CRISPR eksonu 3 ctnnb1 wytwarza izoform β-kateniny.
przeanalizowaliśmy transkrypty obejmujące eksony od 2 do 7 w populacjach komórek leczonych Ctnnb1-sg2, -sg3 i-sg5. Oprócz izoformy pełnej długości, wykryliśmy cztery transkrypty z egzonem 2 widocznie splecionym z każdym kolejnym egzonem (tj. exon 2-4, exon 2-5, exon 2-6 i exon 2-7; rys. 3a, b)., Nie rozumiemy mechanizmu tego pozornie rozwiązłego pomijania eksonu wywołanego edycją eksonu 3 Ctnnb1, ani nie byliśmy w stanie korelować rozwiązłego pomijania eksonu z konkretnymi miejscami docelowymi lub mutacjami indel w eksonie 3. Niemniej jednak wyizolowaliśmy edytowany klon ctnnb1-sg3, który sugeruje potencjalny mechanizm (dodatkowy plik 1: Rysunek S6a). Ten klon bialleliczny zawiera delecję 3-bp na jednym allelu i dużą delecję 832-bp na drugim; delecja 832-bp łączy 5 'koniec IntronA 2 z 3′ końcem eksonu 4 (dodatkowy plik 1: Rysunek S6)., Wykryliśmy dwa transkrypty w tych komórkach: odpowiednio spliced transcript, który zawiera delecję 3-bp oraz transcript, który zawiera intron 2 połączony z eksonem 4 (dodatkowy plik 1: Rysunek S6c i Tabela 1). Wyniki te sugerują, że pozorne pomijanie eksonów wykryte w populacjach edytowanych komórek może odzwierciedlać zmiany w genomie, które usuwają eksony.
dwa eksperymenty popierają ideę, że pojedynczy sgRNA może wywoływać Duże delecje genomowe, które usuwają eksony., Na przykład wyizolowaliśmy 15 klonów z komórek myszy 3T3 przechodnio transfigurowanych Cas9 i ctnnb1-sg1 i odkryliśmy, że cztery klony (tj. klony 4, 5, 13 i 15) wykazały pozorne pomijanie eksonu przez RT-PCR. Genomic PCR ujawnił zmiany genomu w trzech z tych klonów: Duże delecje (>500 bp) i mniejsze delecje (~100 bp) w Klonach 4 i 15 oraz duże wstawki w Klonach 13 i 15 (dodatkowy plik 1: Rysunek S7)., Co więcej, po namierzeniu eksonu 6 p65/RelA wyizolowaliśmy bialleliczny klon p65 (#15): jeden allel zawiera wstawianie 1-nt „+A”, a drugi usuwa delecję 2268-bp, która usuwa eksony 5, 6 i 7 (dodatkowy plik 1: Rysunek S8a, c–e). W klonie P65 # 15 wykryliśmy w pełni spliced transkrypcję i produkt splice exon 4-8 (dodatkowy plik 1: Rysunek S8c). Oba allele kodują stenogramy frameshift i oba stenogramy p65 są obecne na niższych poziomach niż WT (dodatkowy plik 1: Rysunek S8b)., Wyizolowaliśmy również zmodyfikowany klon P65 (#31) homozygotyczny dla tego samego + a wstawiania co w klonie #15, ale klon #31 nie wytwarza alternatywnie splicowanych transkryptów. Tak więc, transkrypt z eksonu 4-8 w klonie #15 wynika z delecji eksonów 5, 6 i 7. Te duże delecje eksonów były nieoczekiwane i można je było przegapić przy użyciu typowych testów przesiewowych opartych na PCR.,
zdolność do powodowania aktywności gain-of-function przez indukowanie exon pomijanie lub exon excision zasugerował, że CRISPR-medytowana edycja przy użyciu pojedynczego sgRNA może być przydatnym sposobem częściowo ratowania funkcji do genu choroby, który wymaga ratowania niskiego poziomu. CRISPR-pośredniczy homologiczny DNA naprawa używał korygować przedwczesny stop kodon mutacje w Dmd genu w mysim modelu DMD i kilka grupy używali CRISPR usuwać DMD egzony i częściowo przywracać Dmd wyrażenie . Zaprojektowaliśmy cztery lentivirusy sgRNA / Cas9, które atakują różne miejsca w eksonie 23 genu Dmd (rys., 4a, b) oraz myoblasty C2C12, linia komórkowa szeroko stosowana jako model dystrofii mięśniowej Duchenne ' a (DMD) . W komórkach C2C12 transdukowanych DMD sgRNAs wykryto produkt RT-PCR, który odpowiada normalnemu produktowi splotu zawierającemu ekson 23. Sekwencjonowanie tych produktów RT-PCR ujawniło, że tylko Dmd-sg2 skutecznie edytował Ekson 23 Dmd, o czym świadczą mieszane piki sekwencji poza miejscem docelowym sgRNA (dodatkowy plik 1: Rysunek S9). W komórkach transdukowanych Dmd-sg2 Wykryto również produkt RT-PCR odpowiadający eksonowi 22 połączonemu z eksonem 24 (rys. 4c, d)., W ten sposób celowanie w ekson 23 jednym sgRNA może być wystarczające do wywołania częściowego pomijania eksonu i wytworzenia nienaruszonej dystrofiny otwartej ramki odczytu. DMD jest klasycznym przykładem choroby, w której niewielka ilość przywracania funkcjonalnego może zapewnić znaczne korzyści kliniczne .
sgRNA kierująca eksonem 23 Dmd może częściowo przywrócić dystrofinę mRNA w klatce. schemat celowania sgRNA i pomijania mysz Dmd exon 23 oraz lokalizacja podkładów do analizy RT-PCR., Pominięcie eksonu 23 wygeneruje mRNA w kadrze. b sgRNA w egzonie Dmd 23. C RT-analiza PCR komórek mysich mioblastów C2C12 transdukowanych za pomocą lentivirusów kodujących Cas9 i sgDmd1, 2, 3 lub 4. Spodziewane rozmiary pasma to 353 bp i 140 bp. Marker molekularny M. analiza sekwencji d pasma cDNA 140-bp z komórek leczonych sgDmd2 potwierdziła splicing eksonu 22 do eksonu 24