Mice
The following mice were originally from the Jackson Laboratory: C57BL/6 (Jax664), μMT (Jax2288), GFP-expressing (Jax4353), cyan fluorescent protein (CFP)-expressing (Jax 4218), dsRed-expressing (Jax 6051), OVA323–339-specific T-cell-receptor transgenic OT-II (Jax 4194) and HEL-specific Ig-transgenic MD4 (Jax2595)., GPR174-brist möss som genereras av standard gen-inriktning förfaranden för att ersätta den Gpr174 open reading frame med en LacZ/neo kassett med de 129SvEvBrd embryonala stamceller linje (Texas En&M-Institutet för Genomisk Medicin, TG0128). Dessa GPR174-bristfälliga möss var backcrossed till C57BL / 6 möss i 12 generationer. Relevanta möss på C57BL / 6-bakgrunden var interbred för att erhålla GFP-Uttryckande MD4-Möss och dsRed-Uttryckande GPR174-tillräckliga eller bristfälliga MD4-möss., Åldersmatchade kullar mellan 6 och 12 veckors ålder och av de angivna könen användes för experiment. Provstorlekar för musförsök bestämdes empiriskt, och möss slumpmässigt tilldelades kontroll eller experimentell grupp. Ingen bländande var nödvändig för de musförsök som presenteras här. Alla möss bibehölls under specifika patogenfria förhållanden och användes i enlighet med regeringens och Tsinghua Institutional Animal Care and Use Committee guidelines for animal welfare.,
GPR174–GFP BAC transgena möss
sekvenser som kodar för glycin–glycin–serin (GGGS) linker (upprepas fyra gånger) och förbättrad GFP (EGFP) infördes omedelbart innan stoppkodon av GPR174 öppen läsram i mus BAC klon RP23–206J14 genom homolog rekombination. Den modifierade BAC renades och mikroinjekterades in i pronuklein av befruktade ägg för att generera transgena reportrar. En grundare mus som screenades positivt för GFP–Uttryckande B-celler i blodet användes för att ytterligare odla med B6-möss för att fastställa GPR174-GFP-BAC-stammen.,
cellodling, retrovirus och in vitro-transduktion
naiva T-celler eller B-celler isolerades med hjälp av den negativa CD4 T-cellsisoleringssatsen eller den naiva B-cellsisoleringssatsen (Miltenyi Biotec) enligt tillverkarens protokoll. För att överuttrycka målgener i B-celler aktiverades renade B-celler med 1 µg ml-1 lipopolysackarid (Sigma)för 1 dag innan de var spinninfekterade med retrovirala supernatanter vid 1,500 g för 2 h, som beskrivet18.
konstruktion av benmärgs chimaeras
B6 mottagarmöss bestrålades dödligt av röntgen (5.,5 Gy, två gånger) och sedan ges en intravenös överföring av 3 × 106 könsmatchade benmärgsceller, bestående av 80% µMT-celler och 20% GPR174-tillräckliga eller bristfälliga celler. Chimaeras användes för experiment sex till åtta veckor efter rekonstituering.
Gonadektomi
möss efter avvänjning bedövades med avertin (2, 5%, 0, 015 ml g−1 kroppsvikt) intraperitonealt. För ovariektomi hos kvinnliga möss exponerades äggstockar på båda sidor och avlägsnades genom bilaterala dorsala snitt., För orchidektomi hos manliga möss gjordes ett medianabdominellt snitt för att exponera och ta bort testiklar på båda sidor. Shamdrivna kontrollmöss genomgick operation inklusive bilaterala dorsala snitt eller ett median abdominalt snitt utan avlägsnande av äggstockar eller testiklar. Kirurgiska såröppningar suturerades och antibiotika och analgetika applicerades lokalt. Möss fick återhämta sig i åtta veckor före efterföljande experiment.,
testosteronbehandling
sex till åtta veckor gamla möss injicerades subkutant med testosteron (10 mg kg – 1 kroppsvikt) upplöst i solrosfröolja varannan dag i två veckor. Fordonskontrollmöss behandlades med solrosfröolja ensam.
Adoptivöverföring, immunisering och virusinfektion
för att mäta bildning av bakteriecentrum med MD4 B-celler överfördes 105 ot-II T-celler och 5 × 105 MD4 B-celler med angivna genotyper intravenöst till manliga B6-mottagare, vilka därefter immuniserades subkutant med 0.,5 µg lipopolysaccharide och 30 µg HEL–OVA konjugat-antigen i alun (Thermo Scientific). HEL-OVA gjordes genom kemisk tvärbindning med ett Hydralinkkonjugationssats (SoluLink) som tidigare beskrivet19. För att mäta germinal-centrumbildning i svar till SRBC immunisering eller lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) infektion, möss injicerades intraperitoneally med 5 × 108 SRBCs (från Z. Baiji) eller 2 × 105 plaque-forming units i LCMV Armstrong virus (från L. Ni och R. Ahmed).,
EAE genom MOG-proteinimmunisering
sekvensen som kodar för de första 120 aminosyrorna av humant MOG förstärktes av polymeraskedjereaktion (PCR) från ett mänskligt hjärnkomplementärt DNA-bibliotek och klonades mellan ndei-och XhoI-platserna i pET22b+ expression vector (Novagen). Humant MOG-protein uttrycktes i BL21(DE3) Escherichia coli och renades genom sin karboxiterminala histidin (His)-tagg. Proteinrenhet och koncentration utvärderades genom SDS-PAGE respektive bicinkoninsyra (BCA) proteinanalys. Rekombinanta proteiner lagrades vid -80 °C till dess användning., För att inducera EAE immuniserades benmärgs-Chimera djur av angivna typer subkutant vid flanken med 200 µg rekombinant humant MOG-protein emulgerat i komplett Freunds adjuvans dag 0. Möss injicerades intravenöst med 200 ng pertussistoxin (Invitrogen) på dag 0 och 2. Möss övervakades dagligen på ett blind sätt för sjukdomsprogression från dag 1. Sjukdomens svårighetsgrad gjordes enligt följande: 0, inga kliniska tecken; 1, förlamad svans; 2, förlust av samordnad rörelse och pares av bakben; 2,5, förlamning av en bakben; 3, förlamning av båda bakbenen; 3.,5, förlamning av både bakben och svaghet i frambenen; 4, förlamning av framben; och 5, moribund. För att jämföra sjukdomens svårighetsgrad studerade vi tio möss per tillstånd per experiment och analyserade sjukdomspoäng över tiden med tvåvägs ANOVA.
flödescytometri
mätning av antigenspecifika antikroppstitrar
för att mäta srbc-specifika antikroppstitrar lyserade vi 5 × 108 SRBCs med 1 ml dubbeldestillerat vatten och centrifugerade dem vid 15 000 r.p.m. i 20 min., Pelleten resuspenderades i PBS och användes för att belägga MaxiSorp enzymbundna immunosorbentanalys (ELISA) plattor (Nunc Maxisorp) över natten vid 4 °C. För att mäta MOG-specifika serumantikroppar använde vi 2 µg ml-1 renat rekombinant humant MOG för att belägga ELISA−plattorna. Ospecifik bindning blockerades med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS med tween-20 (PBST) för 2 h vid 37 °C, följt av inkubation med 2× seriella utspädningar av serumprover av immuniserade möss för 1 h vid 37 °C., Plattorna tvättades och inkuberades med pepparrotperoxidas (HRP)-konjugerad anti-mus IgG sekundär antikropp (1/20,000) för 1 h vid 37 °C. plattorna tvättades, utvecklades med 3,3′,5,5′-tetrametylbensidin (TMB) och stoppades med 1 M HCl. Vi sätter tomma brunnar som noll, och registreras absorbansen vid 450 nm. Vi använde sera från unimmuniserade möss som negativ kontroll; brytvärdet var den optiska densiteten vid 450 nm (OD450) av den negativa kontrollen multiplicerad med 2.1. En brunn med ett OD450-värde på inte mindre än brytvärdet ansågs vara positiv., Den högsta utspädningen av ett prov som gav positivitet är provets titer.
fördelning av B-celler genom immunhistokemi
för olika experiment överfördes naiva B−celler, B-celler som aktiverats för 1 timme med 10 µg ml-1 F(ab’)2 get anti-mus IgM (Jackson Immunoresearch) eller B-celler som omvandlats med retrovirus till B6-mottagare. Vid behov märktes dessa celler med 1 µM tetrametylrhodamin (TAMRA), 4-klorometyl-6,8-difluoro-7-hydroxikumarin (cmf2hc) eller 5-klorometylfluoresceindiacetat (Cmfda) (Invitrogen)., Spleens eller inguinala lymfkörtlar hos mottagarmössen fixerades med 1% paraformaldehyd för 12 h och dehydrerades sedan i 30% sackaroslösning för 12 h vid 4 °C. För att säkerställa maximal representation av olika organområden i den slutliga datasetten behandlade vi icke-konsecutiva vävnadsdelar och färgade dem med indikerade antikroppar. Färgning reagenser som ingår eFluor450-IgD (eBioscience), APC-CD35 (BD), PE-CD3 (BD), eFluor450-B220 (eBioscience), kanin-anti-GFP (abcam), och AF488 get anti-kanin IgG (Invitrogen)., Diabilder monterades med ProlongGold Antifade reagens (Invitrogen) och undersöktes med ett Olympus FV1000 upprätt mikroskop. Bilderna analyserades med Imaris (Bitplan) och ImageJ 1.46 r (National Institutes of Health).
Splenic stroma preparation
Spleens från möss, råttor eller grisar trycktes upprepade gånger och males mot ett metallnät för att frigöra röda blodkroppar och lymfocyter. De återstående insuspenderbara, amorfa stromala vävnadselementen tvättades noggrant med PBS innan de placerades i B27 serumfritt odlingsmedium (Invitrogen) och inkuberades vid 37 °C under 12 h., För möss odlades stromalelement från tre djur i 1 ml medium. För grisar odlades stromalelement från 1 mjälte i 80 ml. Den resulterande kulturen centrifugerades vid 10 000 r. p. m. för 60 min för att erhålla det konditionerade mediet, som antingen omedelbart användes för experiment eller frystes vid -20 °C tills användning.
Transwell−analys
b-celler aktiverade med 1 µg ml-1 lipopolysackarid för 60 h användes för att analysera olika fraktioner som härrör från biokemisk fraktionering., Naiva B-celler eller B-celler aktiverade med 10 µg ml-1 F (ab’)2 get anti-mus IgM (Jackson Immunoresearch) och 10 µg ml−1 Anti-CD40 (klon FGK4.5, Bio X Cell) användes för att analysera CCL21-inducerad migration. När B-celler av olika genotyper jämfördes användes minst tre givarmöss av varje genotyp och behandling för att isolera B-celler i varje experiment, och kullar användes alltid. B-celler suspenderades vid 106 celler per milliliter och vilade i RPMI-medium innehållande 1% FBS vid 37 ° C i 1 timme., Därefter tillsattes totalt 100 µl cellsuspension till den övre kammaren i en 5-µm-pore Transwell (Corning Costar), och totalt 150 µl attraktanthaltiga lösningar tillsattes till bottenkammaren. Dessa lösningar inkluderade odlingsmedium konditionerat med rå mus splenisk stromaberedning, odlingsmedium konditionerat med rå porcin splenisk stromaberedning, elueringsfraktioner från kromatografi, odlingsmedium innehållande rekombinant CCL21 och CCL19 (Peprotech) eller 18/0 LysoPS (Avanti polära lipider) av angivna koncentrationer., För vissa experiment, murina stroma luftkonditionerade medium var först kompletteras med en slutlig koncentration på 5 µg ml−1 neutraliserande antikroppar mot musen CCL21 eller CCL19 (R&D-system) eller get-IgG-isotyp kontroll, och inkuberas vid 4 °C under 3 h innan den används för transwell analysen. Antikroppsdosen var åtminstone tillräcklig för att neutralisera 100 ng ml-1 CCL21 eller CCL19, vilket bestämdes i preliminära experiment. Celler fick transmigrera i 3 h vid 37 ° C i en inkubator., Celler som hade migrerat till de nedre brunnarna räknades upp av flödescytometri, med fluorescerande A20-celler med kända tal tillsatta omedelbart innan de lästes som en intern räkningsstandard. Varje tillstånd mättes i tre exemplar om inget annat anges.
Biokemiska fraktionering
Kromatografi genomfördes med hjälp av en ÄKTApurifer 10 snabbt protein liquid chromatography (FPLC) system (GE Healthcare) vid 4 °C, med undantag för det sista steget, som genomfördes med hjälp av en ÄKTAmicro FPLC system (GE Healthcare)., Totalt 1 200 ml porcin stroma-konditionerat medium applicerades på en anjonbyteskolonn (250 ml bäddvolym) jämvikt med buffert i (25 mM Hepes, pH 7.0). Kolonnen tvättades med tre kolonnvolymer innan den eluerades med tre kolonnvolymer buffert i kompletterat med 1 M NaCl. Genomströmningen var buffert-ändrad med buffert II (25 mM Tris-HCl, pH 8,5) till 100 ml och återanvändes till en anjon-utbyteskolonn jämvikt med buffert II. kolonnen tvättades med två kolumnvolymer av buffert II och eluerades med två kolumnvolymer av en 0,1–0,5 m linjär NaCl-gradient., Fraktioner av 10 ml varje samlades in, och alikvoter var buffert-ändras med RPMI 1640 för transwell analysen. Aktiva fraktioner Poolas och buffert-ändras till 10 ml med buffert II och laddas på en heparinkolonn (5 ml bäddvolym) jämvikt med buffert II. kolonnen tvättades med 12 kolumnvolymer buffert II och eluerades med 4 kolumnvolymer av 0-2 m linjär NaCl-gradient. Fraktioner av 2 ml vardera samlades in och aliquots var buffert-ändrade med RPMI 1640 för transwell-analysen. Aktiva fraktioner poolades igen, buffert-ändrades till 0.,5 ml buffert i och laddad på en Superdex-75-kolonn (24 ml bäddvolym) jämvikt med buffert I. kolonnen eluerades sedan med en kolumnvolym av buffert I. fraktioner av 0,5 ml vardera samlades in och alikvot var buffert-ändrad med RPMI 1640 för transwell-analysen. Aktiva fraktioner poolades och koncentrerades till 0,5 ml för att ladda på en Mono s-kolonn (1 ml bäddvolym) jämvikt med buffert I. kolonnen tvättades med 12 kolumnvolymer buffert i och eluerades med 25 kolumnvolymer av 0-0, 5 m linjär NaCl-gradient., Fraktioner av 1 ml vardera samlades in, och alikvot var buffert-ändrad med RPMI 1640 för transwell-analysen. Aktiva fraktioner poolades, bufferten ändrades och koncentrerades till 50 µl med buffert I, och reloaded på Mono s kolonnen jämvikt med buffert I. kolonnen tvättades med tre kolumnvolymer av buffert i innehållande 0,3 m NaCl och eluerades med 24 kolumnvolymer av 0,3-0,4 m linjär NaCl-gradient., Fraktioner av 1 ml varje samlades in, och alikvoter var buffert-ändras med RPMI 1640 för den slutliga transwell analys för att identifiera den fraktion som innehöll den starkaste chemoattractant verksamhet.
Masspektrometrianalys
fraktioner från det sista reningssteget koncentrerades till 50 µl och analyserades på 12% Nupagegeler (Invitrogen). Geler färgades med Pierce silver fläcken för masspektrometri (Thermo Fisher Scientific) enligt tillverkarens protokoll., Band med ökad intensitet i fraktionen som innehåller den starkaste kemoattraktanta aktiviteten skars ut och utsattes för digestion i gelén innan de analyserades med en Q Exactive HF-masspektrometer (Thermo Fisher Scientific). Masspektrometridata analyserades med hjälp av Swissprot-databasen med MASCOT-sökmotorn.
Hans-märkta rekombinant CCL21 och bindande analysen
musen CCL21 kodande sekvens förstärktes från C57BL/6 musen mjälte cDNA och klonade mellan NdeI och XhoI platser av pET22b+ uttryck vektorn (Novagen), som ger en C-terminal Hans tag., Det rekombinanta proteinet uttrycktes i bl21 (DE3) Möss och renades med sin tagg. Proteinrenhet och koncentration utvärderades genom SDS–PAGE respektive BCA-analys och bioaktivitet verifierades med hjälp av en kalciummobiliseringstest. Rekombinanta proteiner lagrades vid -80 °C till dess användning. För att mäta CCL21–Hans bindning till GPR174, med CCR7 som en positiv kontroll, 293T celler var transfected med GPR174–GFP eller CCR7–GFP fusion konstruktioner., Alikvoter av transfekterade celler inkuberades sedan med CCL21 – hans protein vid angivna koncentrationer vid 37 ° C i 30 min, tvättades två gånger med kalla PBS och fixerades omedelbart med 4% paraformaldehyd. Efter tvättning i PBS färgades de fasta cellerna med en fykoerytrin-konjugerad Anti-His antikropp (klon J095G46, Biolegend) och analyserades genom flödescytometri., GFP-celler i varje prov fungerade som en icke-specifik bakgrundsfärgning intern kontroll, och den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) av GFP+-celler färgade med phycoerytrin-konjugerad Anti− His antikropp, med MFI av motsvarande GFP-celler subtraherade, användes för att kvantifiera specifik CCL21-bindning.
mätning av kemokinutlöst kalciumflöde
Mus Gpr174 och Ccr7 förstärktes av PCR och klonades in i pRK5-plasmiden. HEK293T-celler transfekterades transient med GPR174-Uttryckande, CCR7-Uttryckande eller kontrollplasmid., Cellerna avlägsnades fysiskt från kulturkärlet 48 h efter transfektion, tvättades två gånger med PBS och färgades med 1 µM Indo-1 (Invitrogen) i PBS vid 37 °C i 30 min. Efter att ha tvättats två gånger med PBS, återsuspenderades cellerna med Hanks balanserade saltlösning (Invitrogen) innehållande 25 mM Hepes och 1% FBS, och hölls på is. När de utsattes för kemokinstimulering togs cellerna först in i ett vattenparti vid 37 ° C för 5 min inkubation och bedömdes sedan på en LSR II-cytometer (BD Biosciences) för att fastställa baslinjen för det ostimulerade tillståndet., Celler stimulerades med en koncentrationsserie av rekombinant CCL21 som sträcker sig från 0, 1 ng ml-1 till 10 µg ml-1. Celler vid varje tillstånd övervakades kontinuerligt och registrerades i 2 min. I slutet sattes ionomycin (Sigma) vidare till provet vid en slutlig koncentration av 1 µg ml−1, och provet övervakades ytterligare och registrerades i 1 min. Indo-1(bundet)/indo-1(fritt) förhållanden användes för att indikera intracellulära Ca2 + – koncentrationer, som analyserades i FlowJo (TreeStar). Den högsta Ca2 + – koncentrationen stimulerad av jonomycin användes som 100% för att normalisera det kalciumsvar som inducerades av CCL21., EC50 uppskattades i GraphPad genom att en treparameterskurva, icke-linjär dos–respons, passerades.
Immunoprecipitation och western blotting
Fräscha isolerade musen B-celler från GPR174–GFP-BAC transgena möss har aktiverats med 10 µg ml−1 F(ab’)2 get-anti-mus IgM och 10 µg ml−1 anti-CD40 för 48 h. Dessa aktiverade B-celler var då inne på 2 × 107 celler per ml i RPMI-medium som innehåller 1% FBS, och de lämnas obehandlade eller stimuleras med 300 ng ml−1 CCL21 vid 37 °C i 30 min. B-celler lyserades sedan omedelbart i 1% NP-40 lysbuffert (25 mM Tris-HCl, pH 7.,4, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 20% glycerol och proteashämmare). För immunoprecipitation av GFP-märkta GPR174, lysates av 108 B-celler inkuberades över natt med 20 µl av GFP–Fällan pärlor (ChromoTek). Efter upprepade tvättar eluerades immunoprecipitater genom inkubation i 0,2 m Glycinbuffert (pH 3,0) i 10 min vid rumstemperatur och neutraliserades sedan med 1 m Tris-HCl (pH 8,5). Proteiner separerades av SDS-sida och överfördes till polyvinylidenmembran (Millipore). Membran blockerades med Tris-buffrad saltlösning innehållande 5% BSA och 0.1% Tween 20., För att detektera målmolekyler genom immunoblotting använde vi antikroppar mot kanin GFP (Abcam), kanin anti-Gai-1 (Abcam), kanin anti-Gai-2 (Abcam) och kanin anti-Ga13 (Abcam). HRP-konjugerad get anti-kanin antikropp köptes från Bioeasytech. Immunoblots upptäcktes med hjälp av förbättrade chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific), och bilderna analyserades med ImageJ programvara.
Kvantitativ PCR
Celler av önskad typ var sorterade med en FACSAria III och utsattes för totalt RNA extraktion med RNeasy Plus Mini eller Micro-kit (Qiagen) enligt tillverkarens instruktioner., RNA var omvänt transkriberat med allt-i-ett RT MasterMix (Abm). Kvantitativ PCR utfördes med qPCR MasterMix (Abm) på ett 7500 realtid PCR-system (Applied Biosystems)., Primers used were as follows: Gapdh sense 5′-TGTTCCTACCCCCAATGTGTC, antisense 5′-TAGCCCAAGATGCCCTTCAGT; Gpr174 sense 5′-AGGCCACACACCTTTTTCCC, antisense 5′-CAGGCCAGGACATCATGGAA; S1pr2 sense 5′-CAACTCCGGGACATAGACCG, antisense 5′-CCAGCGTCTCCTTGGTGTAA; Gpr183 sense 5′- CATAAAAGGACGCCTGCTCG, antisense 5′- TTTCCCACCAGCCCAATGAT; Ccr7 sense 5′-GGTGGCTCTCCTTGTCATTTTC, antisense 5′- TACGTCAGTATCACCAGCCC; Cxcr5 sense 5′- ACTACCCACTAACCCTGGACA, antisense 5′- CGAGGTGGAACAGGAAGGTC., Relativ uttryck av målgener bland olika prover jämfördes efter normalisering mot uttryck av hushålls generna Actb eller Gapdh.
statistisk dataanalys
statistik och grafer utfördes i Prism (Graphpad). Om inte annat anges användes två-tailed unpaired Students t-test för att jämföra endpoint-medel för olika grupper.
rapporteringssammanfattning
ytterligare information om forskningsdesign finns i Naturforskningsrapporteringssammanfattningen som är kopplad till detta dokument.