vad är Sanger sekvensering?
Sanger-sekvensering, även känd som ”chain termination method”, utvecklades av den engelska biokemisten Frederick Sanger och hans kollegor 1977. Denna metod är utformad för att bestämma sekvensen av nukleotidbaser i en bit DNA (vanligen mindre än 1000 bp i längd). Sanger sekvensering med 99.,99% basnoggrannhet anses vara ”guldstandarden” för validering av DNA-sekvenser, inklusive de som redan sekvenserats genom nästa generations sekvensering (NGS). Sanger-sekvensering användes i det mänskliga genomprojektet för att bestämma sekvenserna av relativt små fragment av humant DNA (900 bp eller mindre). Dessa fragment användes för att montera större DNA-fragment och så småningom hela kromosomer.
Sanger sekvensering VS ngs
utvecklingen av NGS-teknik har accelererat genomikforskning. NGS kan samtidigt sekvensera mer än 100 gener och hela genom med låg ingång DNA., Sanger-sekvensering används fortfarande i stor utsträckning i sekvenseringsfältet eftersom det erbjuder flera framstående fördelar: (i) kostnadseffektivitet för sekvensering av enskilda gener och (ii) 99,99% noggrannhet, speciellt lämplig för verifieringssekvensering för platsstyrd mutagenes eller klonade insatser.
hur fungerar Sanger-sekvensering?
i Sanger-sekvensering används en DNA-primer som kompletterar mallen DNA (DNA som ska sekvenseras) som utgångspunkt för DNA-syntes., I närvaro av de fyra deoxinukleotidtrifosfaterna (dNTPs: A, G, C och T) förlänger polymerasen primern genom att tillsätta den kompletterande dNTP till mallen DNA-strängen. För att avgöra vilka nukleotid införlivas i den kedja av nukleotider, fyra dideoxynucleotide trifosfater (ddNTPs: ddATP, ddGTP, ddCTP, och ddTTP) märkta med en tydlig fluorescerande färgämne som används för att avsluta syntes reaktion. Jämfört med dNTPs har ddNTPs en syreatom borttagen från ribonukleotiden, därför kan inte bilda en länk med nästa nukleotid., Efter syntes laddas reaktionsprodukterna i fyra körfält av en enda gel beroende på den olika kedjeavslutande nukleotiden och utsätts för gelelektrofores. Enligt deras storlekar bestäms DNA-sekvensen sålunda.
Figur 1. Strukturen av ddNTP och dNTP.
bildkredit: ”helgenomsekvensering: Figur 1,” Av OpenStax College, biologi).,
Sanger-Sekvenseringssteg
Sanger-sekvenseringsmetoden består av 6 steg:
(1) dubbelsträngat DNA (dsDNA) denatureras till två enkelsträngade DNA (ssDNA).
(2) en primer som motsvarar ena änden av sekvensen är fäst.
(3) Fyra polymeraslösningar med fyra typer av dNTPs men endast en typ av ddNTP läggs till.
(4) DNA-syntesreaktionen initieras och kedjan sträcker sig tills en termineringsnukleotid slumpmässigt införlivas.
(5) de resulterande DNA-fragmenten denatureras till ssDNA.,
(6) de denaturerade fragmenten separeras genom gelelektrofores och sekvensen bestäms.
Figur 2. Sanger-sekvenseringsmetoden i 6 steg (anpassad från Gauthier 2008).