Vi nyligen har använt CRISPR att störa Kras-onkogenen i två oberoende lungcancer, adenocarcinom cellinjer , som härrör från Kras G12D; p53-fl/fl (KP) möss . Vi isolerade två encelliga kloner varje bärramarhifting deletioner i exon 2 (Fig., 1a och ytterligare fil 1: figur S1a): KP1 bär en 2-nt ”- CG” – radering i g12d-allelen och en 1-nt ”-C”-radering i den annars vilda typen (WT) kras-allelen; och KP2 bär en 2-nt ”- GG” – radering. Varken klon ger full längd kras-protein, vilket indikerar att alla tre raderingar stör kras-läsramen.
sgRNA targeting kras inducerar exon hoppar över i encellskloner. en schematisk av en sgRNA riktar exon 2 av mus Kras gen (sgKras)., Den röda pilspetsen betecknar Cas9 klyvningsplatsen. KP1 och KP2 cellinjer omvandlades med lentivirus som kodar Cas9 och sgKras. Två encelliga kloner (KP1 klon och KP2 klon) harbor frameshift deletioner. Svarta pilar indikerar positionerna för omvänd transkription polymeraskedjereaktion (RT-PCR) primers. G12d-kodonet är understruket. B normaliserad Kras read räknas från RNA-sekvensering (RNA-seq) analys av KP föräldraceller (blå) och KP kloner (röd). RNA-seq gjordes två gånger för KP2 klon och tre gånger för de andra grupperna. ”+”betecknar WT-allelen., C RNA-seq visar partiell exon 2 hoppa i KP1 kloner. RNA-seq siffror indikerar läser spänner de angivna exon korsningar. Två representativa biologiska replikat visas. d RT-PCR-analys av kras mRNA upptäcker ett exon 2 hoppat band. De förväntade bandstorlekarna är 331 bp och 209 bp. M, molekylär markör. ”*”betecknar Indel i PCR-produkter från kloner. e Scatter plot som visar 22 exon händelser att ändra i både KP1 och KP2 kloner. Uteslutning av Kras exon 2 är den vanligaste händelsen., Div id=”daeba8c4df”>
Frameshiftmutationer i tidiga exoner är kända för att utlösa nonsens-medierad förfall (NMD), vilket eliminerar mRNAs med för tidiga termineringskodon. När vi analyserade mRNA-sekvensering (RNA-seq) data, men vi fann att uppenbara Kras-mRNA-nivåer (det vill säga den totala normaliserade mRNA läser) var endast minskat med 19% i KP1 celler och 47% i KP2 celler, jämfört med föräldrarnas KP-celler (Fig. 1b). Båda klonerna producerade färre exon 2 läser, men normala nivåer av exon 1 och 3 läser (Fig., 1c), vilket tyder på att exon 2 kan hoppas över i KP1 och KP2 kloner. Faktum är att vi upptäckte exon 1-3 junction läser, vilket indikerar att exon 2 hoppas över (Fig. 1C och ytterligare fil 1: figur S1B). Beräkning av förhållandet mellan exon 2 läser och total läser, fann vi att exon 2 ingår i endast 64,0 ± 9,1% av Kras läser från KP1-klon (Fig. 1c och Tabell 1). Liknande exon 2 hoppa över observerades i KP2-kloner (fil 1: Figur S1c)., Konkordant gav omvänd transkription av Kras mRNA följt av polymeraskedjereaktion (RT-PCR) två produkter: en motsvarade intakt kras komplementärt DNA (cDNA) och den andra motsvarade exon 1-3 isoformen (Fig. 1d). Exon 1-3 isoform behåller en partiell kras öppen läsram som kan initiera översättning från en ATG-kodon i exon 3 (ytterligare fil 1: figur S2) och producera ett allvarligt stympat kras-protein.,
redigering av Kras inducerade inte alternativa splitsningsgenomet. Vi identifierade 97 alternativt skarvas exoner i KP1 celler och 177 händelser i KP2 celler. KP1 och KP2 kloner delad 22 kassett inkludering eller exkludering händelser, med undantag av Kras exon 2 är den största förändringen i både kloner (Fig. 1e och Ytterligare fil 1: Tabell S3). Således, redigering av Kras exon 2 speciellt inducerad hoppa av KRAS exon 2., Framför allt, medan musen Kras G12D (GGU att GAU) avskrifter hoppa inte över exon 2 i föräldrarnas KP-celler, fann vi att ~15% av de mänskliga KRAS G12S (kodon 12 GGU till AGU) avskrifter hoppa exon 2 i A549 mänskliga lung cancer cell-linjen (fil 1: Figur S1d). Vi kunde inte förutsäga vinst eller förlust av exon splice enhancers eller ljuddämpare, men våra data tyder på att sekvenser nära Kras codon 12 främjar exon 2 inkludering i mus och mänskliga Kras. Exon hoppar induceras av CRISPR redigering var inte begränsat till Kras eller mus KP-celler., En ny studie visade att CRISPR-redigering av FLOT1 exon 3 i HeLa-celler kan orsaka hoppa över exon 3, exon 4 eller exons 3, 4 och 5 . Vi upptäckte också sällan exon hoppa över när vi riktade exon 11 av LMNA i mänskliga HCT116 celler (fil 1: Figur S3). Hoppa LMNA exon 11 producerar en in-frame transkript som kan översättas till ett neomorfiskt protein.
för att ytterligare undersöka tanken att exon hoppar kan producera en funktionell in-frame transkript, frågade vi om CRISPR-medierad redigering av Ctnnb1 exon 3 kan inducera exon hoppa och orsaka en förstärkning-of-function fenotyp., Exon 3 av Ctnnb1 kodar phosphoacceptor rester som främjar nedbrytningen av β-Catenin transkriptionsfaktor, genetiska excision av Ctnnb1 exon 3—som är i ram med exon 4—stabiliserar ett konstitutivt aktiv β-Catenin som ackumuleras i kärnan . Vi utformade 11 sgRNAs att målet regioner längs Ctnnb1 exon 3 (Ctnnb1-sg1 att -sg11), transduced enskilda sgRNAs i KP-celler, och som används med hög kapacitet för sekvensering för att analysera omfattningen av redigering på sgRNA målplatsen i varje rad (Fig. 2b x-axel, fil 1: Figur S4 och Ytterligare fil 2: Tabell S4)., Tre sgRNAs (sg6, sg9, och sg10) ineffektivt riktade Ctnnb1. Åtta av Ctnnb1 sgRNAs (sg1 till sg5, sg7, sg8 och sg11) framkallade emellertid Indel på sina målplatser med frekvenser som översteg 20%. Till exempel genererade Ctnnb1-sg1 + T-Infogningar i cirka 65% av läsarna (Fig. 2c). I varje population måltavla för ett starkt Ctnnb1 sgRNA, vi upptäckte tre RT-PCR-produkter som spänner exoner 2 till 5 (Fig. 2d). Huvudprodukten motsvarar det normalt splitsade transkriptet som innehåller exon 3. De andra två produkterna motsvarar alternativt splitsade transkript: en som hoppar över exon 3 (dvs., exon 2-4 skarvning, Fig. 2E) och en som hoppar över både exons 3 och 4 (dvs exon 2-5 Splitsning, Fig. 2f). Ctnnb1 sgRNAs rikta någon DNA-strängen inducerad exon hoppa och Cas9 nuclease aktivitet var viktigt för exon hoppa över (Fig. 3a).
Ctnnb1 sgRNAs targeting exon 3 inducerar exon hoppar över. en schematisk av Ctnnb1-genen. In-frame exon 3 kodar för en hämmande domän: fosforyleringsaminosyror 33, 37, 41 och 45 främjar nedbrytning av β-Cateninproteinet., Förlust av exon 3 stabiliserar β-Catenin. Elva sgRNAs var utformade för att rikta exon 3: starka sgRNAs i röda och svaga sgRNAs i svart, respektive. sgRNAs att använda ”NGG” PAM visas ovan exon 3 och de som använder ”CCN” PAM visas nedan exon 3. B korrelation mellan exon 3 hoppa och sgRNA effektivitet. Genomiska indeler mättes genom djup sekvensering. KP-celler var infekterade med lentivirus. Exon 3 hoppar effektivitet är från (d). Indelerna av sg11 var inte bestämda. sgRNAs som inducerar> 20% indels markeras i rött., C fördelning av sg1-indeler visar att en T-införing (+T) vid Klyvningsstället Cas9 nukleotid 97 av exon 3 (rött pilhuvud) var den vanligaste. PAM-sekvensen är blå. D RT-PCR använder primers spänner exons 2 och 5 visar partiell exon hoppa. M molekylmarkör. sgGFP är en kontroll sgRNA. Exon 3 hoppa band kvantifierades med hjälp av ImageQuant TL programvara och normaliserade till full längd cDNA band. sg4 visade synliga svaga band som inte kunde kvantifieras., e, f Topo kloning och Sanger sekvensering bekräftade att de två stora lägre RT-PCR band i (C) är alternativa skarvning av exon 2-4 respektive exon 2-5, respektive. g Western blot analys av β-Catenin. Full längd β-Catenin är ~86 kD. β-Catenin utan exon 3 (delta exon 3) är ~77 kDa. Actin fungerade som en laddningskontroll
Cas9-nukleasaktivitet som krävs för att hoppa över en eller flera exoner., en RT-PCR-analys av Ctnnb1 mRNA i KP celler transduced med lentiviruses att koda sgCtnnb1.2 och nuclease-defekt Cas9 (dCas9), dCas9-KRAB fusion, eller WT Cas9. RT-PCR utfördes med hjälp av primrar i exoner 2 och 7 på transduced KP cellpopulationer efter puromycin urval och FACS sortering. Exon längd och avläsningsram fas visas. Endast exon 2-4 splice produkten behåller en in-frame β-Catenin kodningssekvens. b RT-PCR-analys av Ctnnb1 mRNA i KP celler transduced med lentiviruses att koda Cas9 och sgGFP, sg3, eller sg5., ”–”, obehandlad
Western blot-analys visade att cellpopulationer som givits ut med de starka sgRNAs producerar ett mindre ~74 kD β-Catenin-protein som motsvarar det som förväntades från exon 2-4 splice-produkten (Fig. 2g). Full längd β-Cateninprotein var inte signifikant utarmat fyra dagar efter transduktion. För att testa om den alternativa skarvningen är beroende av det kontinuerliga uttrycket av Cas9 eller sgRNA i de lentivirala vektorerna, överförde vi Cas9 och Ctnnb1-sg1 eller en icke-riktad sgRNA-kontroll., Sju dagar efter transfektion, när transfekterade Cas9 och guide RNAs bör tömmas, undersökte vi β-Catenin lokalisering genom immunofluorescens. I mus fibroblastceller transfected med en icke-inriktning kontroll sgRNA, β-Catenin lokaliserad till cell korsningar (fil 1: Figur S5a). Däremot är det i många celler transfected med Ctnnb1-sg1, vi upptäckte β-Catenin i kärnan (fil 1: Figur S5a)., Dessa resultat tyder på att kontinuerlig redigering inte krävs för exon hoppar och att exon 3 hoppar inducerad av CRISPR-medierad redigering av Ctnnb1 exon 3 ger en förstärkning av funktionen β-Catenin isoform.
vi analyserade vidare transkript som spänner över exoner 2 till 7 i cellpopulationer behandlade med Ctnnb1-sg2, – sg3 och-sg5. Förutom isoformen i full längd upptäckte vi fyra transkript med exon 2 som tydligen skarvas till varje nedströms exon (dvs exon 2-4, exon 2-5, exon 2-6 och exon 2-7; Fig. 3a, B)., Vi förstår inte mekanismen för detta uppenbarligen promiskuösa exon hoppa inducerad av Ctnnb1 exon 3 redigering, inte heller har vi kunnat korrelera promiskuösa exon hoppa med specifika målplatser eller indel mutationer i exon 3. Ändå isolerade vi en Ctnnb1-sg3-redigerad klon som föreslår en potentiell mekanism (ytterligare fil 1: figur S6a). Den här bialleliska klonen innehåller en 3-bp-radering i ram på en allel och en stor 832-bp-radering på den andra; 832-bp-raderingen säkrar 5-änden av intron 2 till 3-änden av exon 4 (Ytterligare fil 1: figur S6)., Vi upptäckte två transkript i dessa celler: det ordentligt splicerade transkriptet som innehåller 3-bp-raderingen och ett transkript som innehåller intron 2 smält till exon 4 (Ytterligare fil 1: figur S6c och Tabell 1). Dessa resultat tyder på att skenbar exon hoppar upptäcks i populationer av redigerade celler kan återspegla genomet omarrangemang som tar bort exoner.
två experiment stöder tanken att en enda sgRNA kan inducera stora genomiska deletioner som tar bort exoner., Till exempel, vi isolerade 15 kloner från mus 3T3-celler kortvarigt transfected med Cas9 och Ctnnb1-sg1, och fann att fyra kloner (dvs kloner 4, 5, 13, och 15) visade uppenbara exon hoppa med RT-PCR. Genomisk PCR avslöjade genomomarrangemang i tre av dessa kloner: stora deletioner (>500 bp) och mindre deletioner (~100 bp) i kloner 4 och 15, och stora Infogningar i kloner 13 och 15 (ytterligare fil 1: figur S7)., Dessutom, efter inriktning exon 6 av p65/RelA, vi isolerade biallelic p65 klon (#15): en allel hyser en 1-nt ”+En” insättning och den andra hyser en 2268-bp radering som tar bort exoner 5, 6 och 7 (fil 1: Figur S8a, c–e). I P65 clone # 15 upptäckte vi det fullständigt splicerade transkriptet och en exon 4-8 splice-produkt (ytterligare fil 1: figur S8C). Båda allelerna koda frameshifted avskrifter och både p65 avskrifter finns på lägre nivåer än WT (fil 1: Figur S8b)., Vi isolerade också en redigerad P65-klon (#31) homozygot för samma + en insättning som i clone #15, men clone # 31 producerar inte alternativt skarvade transkript. Således resulterar exon 4-8 spliced transcript i clone #15 från raderingen av exons 5, 6 och 7. Dessa stora exon deletionshändelser var oväntade och skulle missas med hjälp av typiska PCR-baserade screeningtester.,
förmågan att orsaka en förstärkning av funktionsaktivitet genom att inducera exon hoppa eller exon excision föreslog att CRISPR-mediterade redigering med en enda sgRNA kan vara ett användbart sätt att delvis rädda funktion till en sjukdom gen som kräver låg nivå räddning. CRISPR-medierad homolog DNA-reparation har använts för att korrigera för tidiga stoppkodonmutationer i DMD-genen i en musmodell av DMD och flera grupper har använt CRISPR för att radera Dmd-exoner och delvis återställa DMD-uttryck . Vi designade fyra sgRNA / Cas9 lentivirus som riktar sig mot olika platser i exon 23 av DMD-genen (Fig., 4A, b) och transducerade mus c2c12 myoblaster, en cellinje som ofta används som modell för Duchennes muskeldystrofi (DMD) . I c2c12-celler som givits ut med Dmd sgRNAs upptäckte vi en RT-PCR-produkt som motsvarar den normala skarvprodukten som innehåller exon 23. Sekvensering av dessa RT-PCR-produkter visade att endast DMD-sg2 effektivt redigerade Dmd exon 23, vilket framgår av blandade sekvenstoppar bortom sgRNA-målplatsen (ytterligare fil 1: figur S9). I celler som givits med Dmd-sg2 upptäckte vi också en RT-PCR-produkt som motsvarar exon 22 skarvad till exon 24 (Fig. 4c, d)., Således kan inriktning exon 23 Med en sgRNA vara tillräcklig för att inducera partiell exon hoppa och producera en intakt dystrofin öppen läsram. DMD är ett klassiskt exempel på en sjukdom där en liten mängd funktionell restaurering kan ge betydande klinisk fördel .
en sgRNA-inriktning exon 23 av Dmd kan delvis återställa dystrofin mRNA i ramen. en Schematisk bild av sgRNA inriktning och hoppa av musen Dmd exon 23 och placering av primers för RT-PCR analys., Hoppa över exon 23 kommer att generera in-frame mRNA. b sgRNA målplatser i DMD exon 23. c RT-PCR-analys av C2C12 musen myoblast celler transduced med lentiviruses att koda Cas9 och sgDmd1, 2, 3 eller 4. De förväntade bandstorlekarna är 353 bp och 140 bp. M molekylmarkör. D sekvensanalys av 140-bp cDNA-bandet från sgDmd2-behandlade celler bekräftade skarvning av exon 22 till exon 24