virus de la myéloblastose aviaire (AMV) la transcriptase inverse est l’une des Str les plus couramment utilisées en laboratoire. L’hétérodimère 170kDa nécessite 6-10mm Mg2 + ou Mn2 + pour l’activité, et les réactions incluent souvent le pyrophosphate de sodium et la spermidine pour augmenter la production d’ADNc sur toute la longueur et diminuer la formation d’épingles à cheveux pendant la synthèse (3). AMV RT est moins sensible à l’inhibition par la structure secondaire de L’ARN fort que le virus de la leucémie murine de Moloney (m-MLV) RT (4).,
l’activité enzymatique optimale et la longueur maximale de l’ADNc se produisent à 42-48°C, mais la température de réaction peut varier de 25°C à 58°C (5). La température de réaction plus élevée aide à dénaturer les régions de la structure secondaire de L’ARN fort, ce qui peut provoquer le décrochage du RTs et limiter la taille de l’ADNc (6-7). Pour cette raison, AMV RT est souvent utilisé pour transcrire les ARN avec une structure secondaire Forte. Comme les autres RTs, AMV RT est compatible avec les amorces spécifiques au gène, les amorces oligo(dT)15 ou les hexamères aléatoires, bien que l’utilisation D’hexamères aléatoires nécessite une température de réaction réduite de 37°C., Des amorces RT spécifiques au gène avec des températures de fusion convenablement élevées sont recommandées lorsque la température de réaction dépasse 42°C.
bien que des températures de réaction élevées puissent résoudre efficacement des régions de structures secondaires fortes, ces températures sont préjudiciables à l’intégrité de l’ARN. L’ARN est thermolabile et sensible à la dégradation catalysée par le métal. Normalement, l’hydrolyse se produit à basse fréquence, mais l’hydrolyse de L’ARN devient préoccupante dans certaines conditions (par exemple, pH non optimal, températures élevées, présence de cations divalents)., Ainsi, la synthèse de l’ADNc—en particulier la synthèse de l’ADNc des ARN longs-bénéficie de ne pas exposer L’ARN à des températures de réaction plus élevées. Pour minimiser le temps que l’ARN passe à des températures élevées, les protocoles de synthèse d’ADNc utilisant AMV et M-MLV RTS incorporent souvent une étape de dénaturation initiale, où L’amorce ARN et RT sont combinées, brièvement chauffées pour aider à dénaturer toute structure secondaire puis rapidement refroidies sur de la glace pour maintenir l’état dénaturé. Le RT, le tampon de réaction et les dNTP sont ajoutés et la réaction est incubée à la température souhaitée.,
AMV RT possède une activité intrinsèque de RNase H, qui dégrade le brin D’ARN d’un hybride ARN / ADN et peut cliver le gabarit D’ARN si le RT s’arrête pendant la synthèse (8). Cela réduit le rendement total de l’ADNc et le pourcentage d’ADNc pleine longueur, limitant L’utilité de L’AMV RT pour transcrire les ARN de plus de ~5 Ko.
les conditions typiques de RT-PCR incluent l’utilisation jusqu’à 5µg d’ARN total ou jusqu’à 100ng de polyA+ ARNm, 20-30 unités d’enzyme et une incubation de 60 minutes à 42°C., AMV RT est plus processive que M-MLV RT (5-6), donc moins d’unités sont nécessaires pour générer la même quantité d’ADNc; 25 unités de AMV RT équivaut à environ 200 unités de M-MLV RT. avant la PCR, AMV doit être inactivé parce que AMV RT, comme M-MLV RT, peut inhiber L’ADN polymérase Taq (9). L’enzyme peut être inactivée par chauffage à 70-100°c, suivi d’une incubation de 5 minutes sur glace. La réaction de transcription inverse est souvent diluée avant la PCR ou le volume d’ADNc ajouté à la PCR est limité car la spermidine peut inhiber la PCR (10)., Cette limitation peut nuire à la capacité de détecter les ARN à faible abondance.
AMV RT est recommandé pour la RT-PCR et la RT-qPCR en une et deux étapes, la transcription inverse des ARN<5 Ko et l’extension d’amorce, en particulier si l’ARN de gabarit a une forte structure secondaire.