la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (VMA) es una de las RTs más comunes utilizadas en el laboratorio. El heterodímero de 170kDa requiere 6-10 mm Mg2 + o Mn2 + para la actividad, y las reacciones a menudo incluyen pirofosfato de sodio y espermidina para aumentar la producción de ADNc de longitud completa y disminuir la formación de horquillas durante la síntesis (3). La RT de AMV es menos sensible a la inhibición por la estructura secundaria fuerte del ARN que la RT del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) (4).,
la actividad enzimática óptima y la longitud máxima del ADNc se producen a 42-48°C, pero la temperatura de reacción puede variar de 25°C a 58°C (5). La temperatura de reacción más alta ayuda a desnaturalizar regiones de estructura secundaria de ARN fuerte, lo que puede causar que el RTs se detenga y Limite el tamaño del ADNc (6-7). Por esta razón, la RT AMV se usa a menudo para transcribir reversamente ARN con una fuerte estructura secundaria. Al igual que otros RTs, AMV RT es compatible con cebadores específicos de genes, oligo(dT)15 cebadores o hexámeros aleatorios, aunque el uso de hexámeros aleatorios requiere una temperatura de reacción reducida de 37°C., Se recomiendan cebadores de RT específicos de genes con temperaturas de fusión adecuadamente altas cuando la temperatura de reacción supera los 42°C.
aunque las altas temperaturas de reacción pueden resolver efectivamente regiones de estructuras secundarias fuertes, estas temperaturas son perjudiciales para la integridad del ARN. El ARN es termolábil y susceptible a la degradación catalizada por metales. Normalmente, la hidrólisis ocurre a baja frecuencia, pero la hidrólisis del ARN se convierte en una preocupación bajo ciertas condiciones (por ejemplo, pH no óptimo, altas temperaturas, la presencia de cationes divalentes)., Por lo tanto, la síntesis de ADNc—en particular la síntesis de ADNc de ARN largos—se beneficia de no exponer el ARN a temperaturas de reacción más altas. Para minimizar la cantidad de tiempo que el ARN pasa a altas temperaturas, los protocolos de síntesis de ADNc que utilizan AMV y M-MLV RTS a menudo incorporan un paso de desnaturalización inicial, donde el primer ARN y RT se combinan, se calientan brevemente para ayudar a desnaturalizar cualquier estructura secundaria y luego se enfrían rápidamente en hielo para mantener el estado desnaturalizado. Se agrega el RT, el tampón de reacción y los dNTPs, y la reacción se incuba a la temperatura deseada.,
La RT AMV posee una actividad intrínseca de la RNasa H, que degrada la cadena de ARN de un híbrido ARN / ADN y puede romper la plantilla de ARN si la RT se detiene durante la síntesis (8). Esto reduce el rendimiento total de ADNc y el porcentaje de ADNc de longitud completa, limitando la utilidad de la RT de AMV para transcribir reversamente ARN de más de ~5 Kb.
las condiciones típicas de RT-PCR incluyen el uso de hasta 5µg de ARN total o hasta 100ng de polyA + mRNA, 20-30 unidades de enzima y una incubación de 60 minutos a 42°C., La RT de AMV es más procesiva que la RT de M-MLV (5-6), por lo que se requieren menos unidades para generar la misma cantidad de ADNc; 25 unidades de RT de AMV equivalen a aproximadamente 200 unidades de RT de M-MLV. antes de la PCR, el AMV debe ser inactivado porque la RT de AMV, como la RT de M-MLV, puede inhibir la polimerasa de ADN Taq (9). La enzima se puede inactivar calentando a 70-100°C, seguido de una incubación de 5 minutos en hielo. La reacción de transcripción inversa a menudo se diluye antes de la PCR o el volumen de ADNc añadido a la PCR es limitado porque la espermidina puede inhibir la PCR (10)., Esta limitación puede afectar negativamente la capacidad de detectar ARN de baja abundancia.
AMV RT se recomienda para RT-PCR y RT-qPCR de un paso y dos pasos, transcripción inversa de ARN <5KB y extensión de cebador, particularmente si la plantilla de ARN tiene una fuerte estructura secundaria.